Ein bestimmter Antikörper, derbereits als eine effektive Targeting-Gruppe beschrieben wurde, ist NR-LU-10,ein Maus-monoklonaler Antikörper,der gegen ein menschliches Krebsantigen hergestellt wurde. NR-LU-10ist ein nominaler 150 kD Molekulargewichts-Maus-IgG2b Pankarzinommonoklonaler Antikörper,der ein ungefähr40 Kilodalton Glycoprotein-Antigen erkennt, das auf den meistenKarzinomen exprimiert wird. NR-LU-10 wurde an Hunderte von Patientenin menschlichen klinischen Studien sicher verabreicht. Jedoch ist seinNachteil, daß erein Maus-abgeleiteter monoklonaler Antikörper ist. Dies ist nachteilhaft,da die Immunogenizitätmöglicherweisedie Targeting-Effizienz verringert, falls der Antikörper wiederholtverabreicht wird. Währenddie therapeutische Effizienz erhalten werden kann, indem eine einzigeVerabreichung verwendet wird, werden im Augenblick mehrfache Verabreichungsprotokollebevorzugt.
Als ein Mittel zur Verringerung derImmunogenizitätvon Maus-Antikörpernwurden in der Literatur verschiedenen Verfahren berichtet. SolcheVerfahren schließendie Herstellung von chimärenAntikörpernein, die Maus-variable Regionen und menschliche konstante Regionenenthalten, die Herstellung von Single-Chain-Antikörpern, dievariable Bindungssequenzen umfassen die von Maus-Antikörpern abgeleitetsind, die Herstellung von Antigen-bindenden Fragmenten von Maus-Antikörpern, dieaufgrund ihrer kleineren Größe möglicherweiseweniger immunogen sind, die Herstellung von menschlichen monoklonalenAntikörpernund die Herstellung von „humanisierten\" Antikörpern.
Maus-monoklonale Antikörper können, z.B. durch genetisches Rekombinieren der Nukleotidsequenz, die dieMaus-Fv-Region kodiert (d. h. die Antigen bindenden Stellen enthält) oderder die Komplimentaritätbestimmenden Regionen davon mit Nukleotidsequenzen, die für die menschlichekonstante Regionen kodieren (die von der Fc-Region des Antikörpers umfaßt sind) human-ähnlichergemacht werden. Diese Antikörperwerden normalerweise als chimäreAntikörperbezeichnet.
In dieser Hinsicht wurde ein chimärer Antikörper, dervon NR-LU-10 abgeleitet wurde, bezeichnet als NR-LU-13, früher beschrieben.Dieser Antikörperenthältdie Maus-Fv-Region von NR-LU-10 und umfaßt daher dieselbe Bindungsspezifität, wie NR-LU-10.Daher bindet dieser chimäreAntikörperan das NR-LU-10-Antigen.
Weiden et al. (J. Nucl. Med. 34:2111–2119,1993) beschreiben einen Maus-humanen chimären monoklonalen Antikörper (NR-LU-13)und seine Verwendung, wenn Radiomarkiert mit einem bifunktionellenChelat. Leung et al. (Molec. Immun. 32: 1413–1427, 1995) beschreiben einenAnti-B-Lymphoma monoklonalen Antikörper (LL2), in dem die Glycosylierungentweder durch enzymatische Behandlung oder durch Orts-gerichteteMutagenese eliminiert wurde.
Die Humanisierung stellt Idealerweiseeinen Antikörperzur Verfügung,der nicht-immunogen ist und mit einer vollständigen Beibehaltung der Antigen-bindendenEigenschaften des parenteralen nicht-humanen Antikörper-Moleküls. DieNicht-Immunogenizitätermöglichtdie Verabreichung von multiplen Dosierungen ohne nachteilhafte immunogeneReaktion. Verschiedene Verfahren zur Herstellung von humanisiertenAntikörpernwurden in der Literatur berichtet. Zum Beispiel können humanisierteAntikörperpotentiell hergestellt werden: (a) durch Graften der nicht-humanenCDRs auf ein menschliches Gerüstund konstante Regionen (Jones et al., Nature 321 : 522–25 (1986);Verhoeyen et al., Science 239: 1534–1536 (1988)); oder (b) durchTransplantieren der gesamten nicht-humanen variablen Domänen (umdie Liganden-bindenden Eigenschaften zu erhalten), jedoch ein „Bedecken\" dieser mit einerhuman-ähnlichenOberflächedurch Ersetzen von exponierten Resten, um die Immunogenizität zu verringern(auch als „veneered\" Antikörper bezeichnet)(Padlan, Molec. Immun. 28: 489–498(1991); Padlan, Molec. Immun. 31(3): 169–217 (1994)).
Die Beibehaltung von Maus-Restenzusammen mit humanen variable Region-Gerüst-Domänenhilft berichteter Weise dabei, die geeignete Bindungsfunktion deserhaltenen humanisierten Antikörpersbeizubehalten. Von humanisierten Antikörpern wurde berichtet, daß sie potentielldie Immunogenizitätin einem Wirtsempfängerverringern oder eliminieren, wodurch ein Anstieg in der Bioverfügbarkeitund eine Verringerung in der Möglichkeitvon nachteilhaften Immunreaktionen ermöglicht wird, was daher potentielldie mehrfache Antikörper-Verabreichungenermöglicht.Auch umfaßtdie Synthese von scFv und Antikörper-Fragmenten,wie zum Beispiel Fv-, Fd-, Fab-, Fab\'-, und F(ab)\'2-Fragmenten,abgeleitet von Antikörpern,die eine gewünschte Bindungsspezifität aufweisen,ein anderes bekanntes Mittel zur Herstellung von Targeting-Gruppen,die weniger Immunogenizitätaufweisen, als intakte Antikörper.Im wesentlichen könntenSingle-Chain-Antikörperund Antikörper-Fragmenteaufgrund ihrer kleineren Größe wenigerimmunogen sein, als intakte Antikörper.
Es ist auch bekannt, daß rekombinanteProteine, zum Beispiel Antikörper,in verschiedenen Wirtszellen, die für die Expression verwendetwerden, verschieden glycosyliert werden. Im wesentlich haben verschiedeneWirtszellen eine charakteristische Weise mit der sie spezifischeStellen auf Proteinen glycosylieren, die als Glycosylierungsstellenoder Glycosylierungsmotive bezeichnet werden.
Zum Beispiel glycosylieren PflanzenzellenProteine hauptsächlichdurch O-verbundene Glycosylierung, wohingegen tierische Zellen Proteinetypischerweise durch N-verbundene und O-verbundene Glycosylierungglycosylieren. Auch variieren die spezifischen Kohlenhydrate unddie Glycosylierungsmuster in Abhängigkeitvon den bestimmten Wirtszellen.
Es wurde in der Literatur berichtet,daß Oligosaccharideinsofern signifikant sein können,wie es das Targeting von Proteinen an bestimmte Stellen betrifft.Darüberhinaus ist es auch bekannt, daß Kohlenhydrate eineimmunogene Antwort hervorrufen können.Demzufolge besteht die Möglichkeit,daß infremden Wirtszellen exprimierte Proteine eine immunogene Antwortaufgrund der Kohlenhydratreste hervorrufen können, die durch die Wirtszelleeingeführtwerden, die fürdie Expression verwendet wird. Dies ist besonders problematisch,falls die fremden Wirtszellen sehr unterschiedlich vom Menschenglycosylieren. Zum Beispiel besteht die Möglichkeit, daß Säugerproteine,die in Pflanzenzellen exprimiert werden, immunogen sein können, daPflanzen Proteine sehr unterschiedlich zu Säugerzellen glycosylieren.
Aufgrund der mit der Immunogenität von Maus-oder chimärenAntikörpern,die an das durch den AntikörperNR-LU-13 gebundene Antigen binden, verbundenen Schwierigkeiten bestehtein Bedarf im Stand der Technik für verbesserte Zusammensetzungenund Verfahren. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und stelltweiterhin damit zusammenhängendeVorteile zur Verfügung.
ZUSAMMENFASSUNGDER ERFINDUNGEs ist eine Aufgabe der Erfindunghumanisierte Antikörperzur Verfügungzu stellen, die von NR-LU-13 (oder von anderen nicht-humanen Antikörpern, diedas durch NR-LU-13 gebundene Antigen binden) abgeleitet sind zurVerfügungzu stellen oder Fragmente von solchen humanisierten Antikörpern, dieeine verringerte Immunogenizitätoder Toxizitätin Menschen zeigen, jedoch ihre Fähigkeit beibehalten, das NR-LU-13-Antigenzu binden.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegendenErfindung, Konjugate zur Verfügungzu stellen, die von NR-LU-13 abgeleitete Antikörper enthalten oder von anderennicht-humanen Fragmenten davon, die das durch NR-LU-13 gebundeneAntigen binden.
Es ist noch eine weitere Aufgabeder Erfindung, verbesserte zwei-Schritt-Pretargeting-Verfahren zur Verfügung zustellen, wobei die Verbesserung die Verwendung eines humanisiertenAntikörpersals die Targeting-Gruppe umfaßt,der von NR-LU-13 abgeleitet ist oder von einem anderen nicht-humanenAntikörperoder Fragmenten davon, die das durch NR-LU-13 gebundene Antigenbinden.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung,verbesserte drei-Schritt-Targeting-Verfahren zur Verfügung zustellen, wobei die Verbesserung die Verwendung eines humanisiertenAntikörpersals die Targeting-Gruppe umfaßt,der von NR-LU-13 abgeleitet ist oder von einem anderen nicht-humanenAntikörperoder Fragmenten davon, die das durch NR-LU-13 gebundene Antigenbinden.
Es ist noch eine weitere Erfindungder vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen zur Behandlung oderder Diagnose zur Verfügungzu stellen, die Konjugate enthalten, die humanisierte Antikörper umfassen, dievon NR-LU-13 abgeleitet sind oder von anderen nichthumanen Antikörpern oderFragmenten davon, die das durch NR-LU-13 gebundene Antigen binden.
Es ist eine genauere Aufgabe derErfindung, Konjugate zur Verfügungzu stellen, die einen humanisierten Antikörper umfassen, der von NR-LU-13abgeleitet ist oder ein Fragment davon, das in der Lage ist, dasdurch NR-LU-13 gebundene Antigen zu binden, der/das direkt oderindirekt angebracht ist an ein Mitglied eines Liganden- oder Anti-Liganden-Partners,bevorzugterweise Avidin oder Streptavidin oder ein Fragment oderein Derivat davon, das in der Lage ist, Biotin zu binden.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung,ein Konjugat zur Verfügungzu stellen, das einen von NR-LU-13 abgeleiteten humanisierten Antikörper umfaßt oderein Fragment davon, das das durch NR-LU-13 gebundene Antigen bindet,zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder der Diagnosevon Krebs.
Es ist eine noch genauere spezifischeAufgabe der Erfindung, spezifische humanisierte variable schwereund leichte Kettensequenzen abgeleitet von NR-LU-13 herzustellen,die hier als humanisierte NRX451 bezeichnet werden, oder Fragmentedavon, die an das durch NR-LU-13gebundene Antigen binden.
Es ist eine weitere spezifische Aufgabeder Erfindung, Zusammensetzungen zur Behandlung oder der Diagnosevon Krebs zur Verfügungzu stellen, unter der Verwendung von humanisiertem NRX451 oder Fragmentendavon, die das durch NR-LU-13 gebundene Antigen binden.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung,Antikörperherzustellen, insbesondere Maus-, chimäre oder humanisierte Antikörper, diemutiert wurden, um so eine oder mehrere potentielle Glycosylierungsstellenzu eliminieren und dadurch die Immunogenizität oder Toxizität zu verringern.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegendenErfindung, Antikörperin Pretargeting-Verfahren und der herkömmlichen Antikörper-Therapiezu verwenden, bevorzugterweise humanisierte Antikörper, diemutiert wurden, um die N-verbundene Glycosylierung zu eliminierenoder modifiziert wurden, um die N-verbundene Glycosylierung zu verringern.
Daher stellt die vorliegende Erfindungeinen humanisierten Antikörperoder Antigenbindendes humanisiertes Antikörper-Fragment zur Verfügung, wobeider Antikörperoder das Antikörper-Fragmentspezifisch an das durch den Antikörper NR-LU-13 gebundene Antigenbindet, und, bevorzugterweise, wobei der Antikörper oder das Antikörper-Fragmententweder keine N-verbundene Glycosylierung besitzt oder seine N-verbundeneGlycosylierung nach der Expression modifiziert wurde, um die Immunogenizität oder Toxizität zu verringern.Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verringerungder Immunogenizitätoder Toxizität einesAntikörpersoder eines Antigen-bindenden Antikörper-Fragments der IgG-Klasse zur Verfügung, umfassenddie Schritte von (a) Auswähleneines Wirtssystems auf die Eigenschaft hin, daß das System einen Antikörper oderAntikörper-Fragmentnicht Nverbunden glycosyliert; und (b) Exprimieren einer Nukleotidsequenz, dieNukleinsäurenumfaßt(z. B. DNA oder RNA oder funktionelle Äquivalente) die für einenIgG-Anitkörper oderAntigen-bindendes Antikörper-Fragmentkodiert in dem Wirstsystem. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhinein Verfahren zur Eliminierung N-verbundener Glycosylierung in einemAntikörperoder einem Antigen-bindenden Antikörper-Fragment der IgG-Klassezur Verfügung,um die Immunogenizitätoder Toxizitätzu verringern, umfassend Exprimieren in einem Wirtssystem einerNukleotidsequenz, die Nukleinsäuren(z. B. DNA oder RNA oder funktionelle Äquivalente) umfaßt, diefür einenIgG-Antikörperoder ein Antigen-bindendes Antikörper-Fragmentkodiert, wobei das Wirtssystem den Antikörper oder das Antikörper-Fragment nicht N-verbundenglycosyliert. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahrenzur Modifikation der N-verbundenen Glycosylierung eines Antikörpers oderAntigen-bindenden Antikörper-Fragmentsder IgG-Klasse (z. B. um die Immunogenizität oder Toxizität zu verringern)zur Verfügung,umfassend Unterziehen des Antikörpersoder Antikörper-Fragmentseiner post-Expressionsmodifikations, die die N-verbundene Glycosylierung modifiziert.In einer bevorzugten Ausführungsformwerden Antikörperoder Fragmente der IgG-Klasse chemisch modifiziert, um die Immunogenizität oder Toxizität zu verringern.
Konjugate werden zur Verfügung gestellt,umfassend einen humanisierten Antikörper oder Antikörper-Fragmentder vorliegenden Erfindung, der direkt oder indirekt an einen Liganden,einen Anti-Liganden, ein diagnostisches Mittel oder therapeutischesMittel angebracht ist. Pharmazeutische Zusammensetzungen werdenzur Verfügunggestellt, umfassend einen Antikörperoder Antikörper-Fragmentoder Konjugat der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einempharmazeutisch akzeptablen Trägeroder Verdünnungsmittel.Ein Antikörperoder Antikörper-Fragmentoder Konjugat oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird zurVerwendung als ein Diagnostikum oder Medikament zur Verfügung gestellt;zur Verwendung in diagnostischen oder therapeutischen Pretargeting-Verfahren; und zurHerstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krebs oder alsMedikament zur Behandlung von Krebs.
Diese und andere Ausführungsformender vorliegenden Erfindung werden nach Bezug auf die vorliegendegenaue Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen ersichtlichwerden.
KURZE BESCHREIBUNGDER ZEICHNUNGEN1 stelltschematisch die Sequenzanalyse und das Computermodeling dar, diedazu verwendet wurden, um humanisierte Antikörper von NR-LU-13 zu synthetisieren.
2 enthält die Nukleotid-und Aminosäuresequenzenvon NR-LU-13 leichte Kette NR-LU-13und schwere Kette variablen Regionen.
3 enthält die Aminosäuresequenzder bevorzugten humanisierten variablen leichten Sequenz, abgeleitetvon NR-LU-13, bezeichnet als humanisierte NRX451-leicht.
4 enthält die Aminosäuresequenzder bevorzugten humanisierten variablen schweren Sequenz, abgeleitetvon NR-LU-13, bezeichnet als humanisierte NRX451-schwer.
5 zeigteinen Vergleich der schweren und leichten Kette Regionen von NR-LU-13und den davon abgeleiteten humanisierten leichten und schweren variablenRegionen, die als NRX451 schwer und NRX451 leicht bezeichnet werden.
6a und 6b enthalten Molekularmodellevon (a) dem Fv von chimäremNR-LU-13 Antikörperund (b) einem davon abgeleiteten humanisierten Fv (NRX451).
7a–7e enthalten Aminosäuresequenzenfür bestimmtePositionen von menschlichen Antikörpersequenzen.
8 stelltein Plasmid pcDNA3 dar, das ein Intermediat für pNRX451-C ist, einem Plasmid,das dazu verwendet wurde, um NRX451 zu exprimieren.
9 stelltdas Plasmid pNRX451-C dar, das dazu verwendet wurde, um NRX451 zuexprimieren.
10 enthält Ergebnissevon kappa und gamma ELISAs fürspezifische NRX451 humanisierter Antikörper produzierende Klone.
11 vergleichtdie Immunreaktivitätvon humanisiertem NRX451-Antikörpermit intaktem NR-LU-10-Antikörperdurch kompetitive Immunreaktivität.
12 vergleichtdie Gewebe-Bioverteilung von verschiedenen Radio-markierten Antikörpern, einschließlich humanisiertenAntikörpern,die gemäß der Erfindunghergestellt wurden.
13 vergleichtdie Bioverteilung von humanisiertem NR-LU-13 (NRX451), exprimiertin CHO-Zellen, Pflanzenzellen und Insektenlarven mit Maus-NR-LU-10,hergestellt in Maus-Hybridomzellen.
14 vergleichtdie Lectin Bindungsprofile des oxidierten/reduzierten und nicht-oxidiertenreduzierten NRX451.
15a–15c zeigen die Komplementvermittelte Cytotoxizitäts-(C\'MC)-Aktivität in nichtmodifizierten undmodifizierten NRX451.
15d zeigtdie Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizitäts-(ADCC)-Aktivität in nichtmodifizierten undmodifizierten NRX451.
16a–16c vergleichen die Bioverteilungeiner 50/50 Koinjektion von markiertem NRX451 und oxidiertem/reduziertemNRX451 in einem Maus-Modell.
17 vergleichtdie Blutentfernung von NRX451 und oxidiertem/reduziertem NRX451in menschlichen Krebspatienten.
18 zeigtdie Komplement vermittelte Cytotoxizität von MCF-7-Zellen, die gegenüber Log-10-Verdünnungenvon CHO-exprimiertem NRX451 (-o-), Mais-exprimiertem NRX451 (-☐-)und der in Mais exprimierten Asn zu Gln Mutante von NRX451 (-Δ-) ausgesetztwurden. Menschliches Serum bei einer finalen Verdünnung von10% war die Quelle von Komplement. Die Ergebnisse sind als ProzentCytotoxizitätangegeben.
19 zeigtMCF-7-Zellen, die gegenüberLog-10-Verdünnungenvon CHO-exprimiertem NRX451 (o-), Mais-exprimiertem NRX 451 (-☐-)und der in Mais exprimierten Asn zu Gln Mutante von NRX451 (-Δ-) ausgesetztwurden. Menschliche periphäremononukleare Zellen wurden auch bei einem Effektor zu Ziel-Zell-Verhältnis von25 : 1 hinzugefügt.Die Ergebnisse sind als Prozent Cytotoxizität angegeben.
20 vergleichtdas Enfernen aus Blut von NRX451 und dem Maus-IgG-Analogon, NR-LU-10, in Mäusen.
21a–21b vergleichen die Bioverteilungvon NRX451 und dem Maus-IgG-Analogon, NR-LU-10 in Tumor-tragendenathymischen Mäusen.
22 zeigtdie Bioverteilung von N-verbundenem glycosyliertem Mutanten-NRX451,die chemisch an Streptavidin konjugiert wurde (SA), exprimiert inMaissamen, in Tumortragenden athymischen Mäusen.
23 zeigtErgebnisse der Entfernung aus Blut des radiomarkierten Mais-exprimiertenNverbunden glycosylierten Mutanten NRX451/SA-Konjugats mit und ohnedie Verwendung eines synthetischen Entfernungsmittels in Mäusen.
24a–24b enthalten die Bioverteilungin Tumor-tragenden athymischen Mäusenvon dem radiomarkiertem in Mais exprimierten N-verbunden glycosyliertenMutanten NRX451/SA-Konjugatund anschließendverabreichtem 111I-DOTA-Biotin unter derVerwendung von Pretargeting-V erfahren.
GENAUE BESCHREIBUNGDER ERFINDUNGVor der weiteren Beschreibung derErfindung kann es fürVerständnisdavon hilfreich sein, Definitionen von bestimmten Ausdrücken anzugeben,die hier im folgenden verwendet werden sollen.
Antikörper – Wie hier verwendet, schließt sowohlpolyklonale und monoklonale Antikörper ein und kann ein intaktesMolekül,ein Fragment davon (wie zum Beispiel Fv-, Fd-, Fab-, Fab\'- und F(ab)\'2-Fragmente oderMultimere oder Aggregate von intakten Molekülen und/oder Fragmenten sein,und kann natürlichauftreten oder hergestellt sein, z. B. durch Immunisierung, Syntheseoder genetisches Engineering.
Protein – Wie hier verwendet, schließt Proteine,Polypeptide und Peptide ein und kann ein intaktes Molekül, ein Fragmentdavon oder Multimere oder Aggregate von intakten Molekülen und/oderFragmenten sein und kann natürlichauftreten oder hergestellt sein, z. B. durch Synthese (einschließlich chemischerund/oder enzymatischer) oder genetischem Engineering.
Humanisierter Antikörper – Dies betriffteinen Antikörper,der von einem nicht-menschlichen Antikörper abgeleitet ist (typischerweiseMaus) oder von einem chimärenAntikörperabgeleitet ist, der die Antigen-bindenden Eigenschaften des parenteralenAntikörpersbeibehältoder im wesentlichen beibehält,der jedoch im Menschen wenig immunogen ist. Dies kann durch verschiedenenVerfahren erreicht werden, einschließlich bespielhaft: (a) Graftingnur der nicht-menschlichen CDRs auf ein menschliches Gerüst und konstantenRegionen (Humanisierung) oder (b) Transplantieren der gesamten nicht-menschlichen variablenDomänen,jedoch „Verhüllen\" dieser mit einerMenschen-ähnlichenOberflächedurch Ersetzen von Oberflächenresten(„Veneering\"). Solche Verfahrensind zum Beispiel beschrieben in Jones et al., Nature 321: 522–525 (1986);Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851–6855 (1984); Morrison undOi, Adv. Immunol. 44: 65–92(1988); Verhoeyer et al., Science 239: 1534–1536 (1988); Padlan, Molec.Immun. 28: 489–498(1991); Padlan, Molec. Immun. 31(3): 169–217 (1994). In der vorliegendenErfindung werden humanisierte Antikörper „humanisierte\" und „veneered\" Antikörper einschließen, schließen jedochchimäreAntikörperaus. Ein bevorzugtes Verfahren der Humanisierung umfaßt ein Abgleichender nicht-menschlichen schweren und leichten Kettensequenzen mit menschlichenschweren und leichten Kettensequenzen, Auswahl und Ersatz des nicht-menschlichenGerüsts miteinem menschlichen Gerüst,basierend auf einem solchen Abgleich, molekulares Modeling, um dieKonformation der humanisierten Sequenz vorherzusagen, und Vergleichmit der Konformation des parenteralen Antikörpers, gefolgt von wiederholterMutation von Resten in der CDR-Region, die die Struktur der CDRsstören,bis die vorhergesagte Konformation des humanisierten Sequenzmodellsder Konformation der nicht-menschlichen CDRs des parenteralen nicht-menschlichenAntikörperseng angenähertist. Dieses Verfahren der Humanisierung wird schematisch in 1 dargestellt. Auch können solchehumanisierten Antikörperweiter derivatisiert werden, um die Aufnahme und Ausscheidung zuerleichtern, z. B. überAshwell-Rezeptoren oder andere Rezeptor-vermittelte Ausscheidungsmechanismen,wie zum Beispiel durch die Inkorporation von Galactoseresten oderanderen Hexosen (z. B. U.S.-Patent-Nrn. 5,530,101 und 5,585,089).
Humanisiertes Antikörper-Fragment – Dies betrifftFragmente, die von einem humanisiertem Antikörper abgeleitet sind, die Antigenbinden und die derivatisiert werden können, um strukturelle Merkmaleaufzuweisen, die die Ausscheidung und die Aufnahme erleichtern,z. B. durch die Inkorporation von Galactoseresten. Dies schließt zum BeispielF(ab), F(ab)\'2, ScFv, leichte Kette variable Region, schwereKette variable Region und Kombinationen davon ein.
Komplementaritäts-bestimmende Region oderCDR – DerAusdruck CDR, wie hier verwendet, betrifft Aminosäuresequenzen,die zusammen die Bindungsaffinitätund – Spezifität der natürlichenFv-Region einer nativen Immunglobulinbindungsstelle definieren (Chothiaet al., J. Mol. Biol. 196: 901–917(1987); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIHPublication Nr. 91-3242 (1991)).
Gerüstregion oder FR – Der AusdruckFR, wie hier verwendet, betrifft Aminosäuresequenzen, die zwischenCDRs zwischengelagert sind. Eine Funktion dieser Teile des Antikörpers istes, die CDRs in einer geeigneten Orientierung zu halten (es denCDRs zu ermöglichen,das Antigen zu binden).
Konstante Region oder CR – Der AusdruckCR, wie hier verwendet, betrifft den Teil des Antikörpermoleküls, derdie Effektorfunktionen überträgt. In dervorliegenden Erfindung werden Maus-konstante Regionen durch menschlichekonstante Regionen ersetzt. Die konstanten Regionen der hier betroffenenhumanisierten Antikörpersind von menschlichen Immunglobulinen abgeleitet. Die schwere Kettekonstante Region kann von jeder der fünf Isotypen ausgewählt sein:alpha, delta, epsilon, gamma oder mü. Weiterhin sind schwere Ketten vonverschiedenen Unterklassen (sowie den IgG-Unterklassen der schwerenKetten) fürdie verschiedenen Effektorfunktionen verantwortlich, und daher können durchAuswählender gewünschtenschweren Kette konstante Regionen chimäre Antikörper mit gewünschterEffektorfunktion hergestellt werden. Bevorzugte humane konstanteRegionen sind gamma 1 (IgG1), gamma (IgG2), gamma 3 (IgG3) und gamma4 (IgG4). Bevorzugt ist eine Fc-Region des gamma 1 (IgG1)-Isotyps.Die leichte Kette konstante Region kann vom kappa- oder lambda-Typsein und ist bevorzugterweise vom kappa-Typ.
Chimärer Antikörper – Dies ist ein Antikörper, derSequenzen enthält,die von zwei verschiedenen Antikörpernabgeleitet sind (z. B. U.S.-Patent-Nr. 4,816,567), die typischerweisevon zwei verschiedenen Spezies stammen. Die meisten typischen chimären Antikörper umfassenmenschliche und Maus-Antikörperfragmenten,im allgemeinen menschliche konstante und Maus-variable Regionen.
NR-LU-10 – Ein Maus-monoklonaler Antikörper desIgG2b-Isotyps, der ein ungefähr40 Kilodalton Glycoprotein-Antigen erkennt, das auf einer großen Vielzahlvon Karzinomen exprimiert wird. Dieser Antikörper ist ein Pankarzinom-Antikörper, derin menschlichen klinischen Studien sicher verabreicht wurde. Dasdurch NR-LU-10 gebundene Antigen wird durch Krebsarten, einschließlich zumBeispiel kleine-Zelle-Lungen, nicht-kleine-Zelle-Lungen, Colon-, Brust-, Nieren-, Eierstock-und Pankreas-, unter anderen Karzinomgeweben, exprimiert. DieserAntikörperwurde früherals eine Targeting-Gruppe in zwei-Schritt und drei-Schritt-Targeting-Verfahrenverwendet.
NR-LU-13 – Ein chimärer monoklonaler Antikörper, derdie variablen leichten und schweren Regionen von NR-LU-10 und menschlichekonstante Regionen enthält.Dieser Antikörperbindet dasselbe Antigen, wie NR-LU-10.
NR-LU-10 oder NR-LU-13 Antigen – DieseBegriffe werden austauschbar verwendet und betreffen das Antigen,das durch NR-LU-10 oder NR-LU-13 gebunden wird, das ein ungefähr 40 KilodaltonGlycoprotein-Antigen ist, das durch viele Karzinome und nicht-Krebsgewebeexprimiert wird.
Humanisiertes NRX451 oder humanisierteNRX451-leicht oder humanisierte NRX451-schwer – Diese Begriffe betreffenspezifische humanisierte variable Domänensequenzen, die von dem Fvvon NR-LU-13 abgeleitet sind.
Humanisierte Antikörper oderhumanisiertes Antikörper-Fragmentoder humanisierte Antikörper-Fragment-Konjugate – Konjugate,die humanisierten Antikörperoder humanisierte Antikörper-Fragmenteder Erfindung enthalten. Diese Konjugate können einen Liganden oder einenAnti-Liganden und/oder ein aktives Mittel, wie infra definiert,einschließen.Der Ligand, Anti-Ligand oder das aktive Mittel können direkt oder indirekt an denhumanisierten Antikörperoder das humanisierte Antikörper-Fragment,z. B. überdie Verwendung von bekannten Linkern, angebracht sein. Diese Konjugatekönnenstrukturelle Merkmale aufweisen oder derivatisiert werden, um dieMerkmale aufzuweisen, die eine Aufnahme und Entfernung davon vermitteln,z. B. durch Inkorporation von Hexosen, wie zum Beispiel Galactose,die die Leberaufnahme übereine Ashwell-Rezeptor-vermittelte Entfernung vermitteln.
Pretargeting – Wie hier definiert, schließ Pretargetingdie Targetstellen-Lokalisierung einer Targeting-Gruppe ein, diemit einem Mitglied eines Ligand-/Anti-Ligand-Paares konjugiert ist;nach einer Zeitdauer die, füreine optimale Target-zu-nicht-Target-Anreicherung dieses Targeting-Gruppen-Konjugatsausreichend ist, wird aktives Mittel, das an das gegenüberliegendeMittel des Liganden-/Anti-Liganden-Paares konjugiert ist, verabreichtund wird (direkt oder indirekt) an das Targeting-Gruppe-Konjugatan der Targetstelle gebunden. Das Pretargeting schließt gegebenenfallsauch einen weiteren Schritt der Verabreichung eines Entfernungsmittelsein.
Targeting Gruppe – Ein Molekül, das eine definierte Populationvon Zellen bindet. Die Targeting-Gruppe kann jedes Target binden,wie zum Beispiel einen Rezeptor, ein Oligonukleotid, ein enzymatischesSubstrat, eine antigene Determinante oder andere Bindungsstelle,die auf oder in der Target-Zell-Population vorhanden ist. Die Targeting-Gruppe kann ein Protein,Peptid, Antikörperund Antikörper-Fragmente,Fusionsproteine und ähnlichessein. Ein Antikörperwird in der Beschreibung als ein prototypisches Beispiel einer Targeting-Gruppe verwendet.Ein Tumor wird als ein prototypisches Beispiel eines Targets verwendet.
Ligand-/Anti-Ligand-Paar – Ein komplementäres/anti-komplementäres Setvon Molekülen,die eine spezifische Bindung zeigen, im allgemeinen von relativhoher Affinität.Beispielhafte Liganden-/Anti-Liganden-Paare schließen Zink-Finger-Proteine/dsDNA-Fragment,Enzym/Inhibitor, Hapten/Antikörper,Lectin/Kohlenhydrat, Ligand/Rezeptor und Biotin/Avidin oder Streptavidinein. Biotin/Avidin oder Streptavidin werden innerhalb der Beschreibungals ein prototypisches Beispiel eines Ligand-/Anti-Ligand-Paaresverwendet.
Ligand – Wie hier definiert, ist ein „Ligand\" ein relativ kleineslöslichesMolekül,das eine schnelle Serum, Blut- und/oder Gesamtkörper-Entfernung zeigt, wennintravenösan ein Tier oder einen Menschen verabreicht. Biotin und Biotin-Analogawerden als der prototypische Ligand verwendet. Analoga von Biotin,die eine verringerte oder verstärkteBindungsaffinitätgegenüberAvidin oder Streptavidin aufweisen, sind im Stand der Technik gutbekannt.
Anti-Ligand – Wie hier definiert, zeigtein „Anti-Ligand\" eine hohe Affinität und bevorzugterweiseeine multivalente Bindung des komplementären Liganden. Bevorzugterweiseist der Anti-Ligand, wenn an eine Targeting-Gruppe konjugiert, groß genug,um eine schnelle Nierenentfernung zu vermeiden und enthält ausreichendMultivalenzen, um eine Kreuzvernetzung und Aggregation von Targeting-Gruppen-Liganden-Konjugaten zu erreichen.Univalente Anti-Liganden werden auch durch die vorliegende Erfindungvorgesehen. Die Anti-Liganden der vorliegenden Erfindung können strukturelleMerkmale aufweisen oder derivatisiert werden, um die strukturellenMerkmale aufzuweisen, die die Aufnahme davon vermitteln, z. B. durchdie Inkorporation von Hexoseresten, die die Leber-Aufnahme vermitteln.Avidin und Streptavidin sind hier als prototypische Anti-Liganden verwendet.
Avidin – Wie hier definiert, schließt „Avidin\" Avidin, Streptavidinund Derivate und Analoga davon ein, die zu einer Hochaffinitäts-, multivalentenoder univalenten Bindung von Biotin in der Lage sind. Beispielhafte Streptavidinmoleküle sindin den U.S.-Patenten Nrn. 5,168,049 und 5,272,254 beschrieben.
Entfernungsmittel – Ein Mittel,das in der Lage ist mit einer verabreichten Gruppe (z. B. Targeting-Gruppe-Ligand,Targeting-Gruppe-Anti-Ligand oder Anti-Ligand alleine) zu binden,zu komplexieren oder sich auf andere Weise zu assoziieren, die imKreislauf des Empfängersvorhanden ist, wodurch die Entfernung der zirkulierenden Gruppeaus dem Körperdes Empfängersbeschleunigt wird, ein Entfernen aus dem Blutkreislauf oder eineInaktivierung des selben Kreislauf. Das Entfernungsmittel ist bevorzugterweisedurch physikalische Eigenschaften charakterisiert, wie zum BeispielGröße, Ladung,Konfiguration oder eine Kombination davon, die einen Zugang desEntfernungsmittels zur Population von Ziel-Zellen, die durch eineTargeting-Gruppe erkannt werden und in demselben Behandlungsprotokollwie das Entfernungsmittel verwendet werden, begrenzen.
Aktives Mittel – Ein diagnostisches oder therapeutischesMittel, einschließlichRadionuklide, Wirkstoffe, Anti-Tumor-Mittel, Cytokine, Hormone,Toxine und ähnliches.Radionuklid therapeutische Mittel sind prototypische aktive Mittel.
Target-Ziel-Rückhalt – Die Zeitdauer, die ein Radionuklidoder ein anderes therapeutisches Mittel auf der Target-Zelloberfläche oderinnerhalb der Target-Zelle verbleibt. Der Katabolismus von Konjugatenoder Molekülen,die solche therapeutischen Mittel enthalten, scheint hauptsächlich für den Verlustder Ziel-Zell-Rückhaltungverantwortlich zu sein.
Konjugat – Ein Konjugat ist ein Molekül, das dieKombination von zwei oder mehreren Molekülen ist (oder Teilen von einemoder allen), die direkt (z. B. kovalent oder nichtkovalent) oderindirekt (z. B. inkorporiert oder indirekt gebunden) miteinanderassoziiert sind. Ein Konjugat schließt chemische Konjugate (kovalent odernicht-kovalent gebunden), Fusionsproteine und ähnliches ein. Konjugate können einenLiganden oder Anti-Liganden und/oder aktives Mittel besitzen.
Immunogenizität – Ein Maß der Fähigkeit eines Targeting-Proteinsoder therapeutischen Gruppe, eine Immunantwort hervorzurufen (humoraloder zellulär),wenn an einen Empfängerverabreicht. Die vorliegende Erfindung betrifft die Immunogenizität von Konjugatenund deren Komponentteilen.
Aglycosylierter Antikörper oderaglycosylierter humanisierter Antikörper – Diese Ausdrücke betreffen Antikörper oderhumanisierte Antikörperoder Antigen-bindende Fragmente davon, die durch Orts-spezifische Mutagenesemutagenisiert wurden, um die Aminosäurereste an Stellen zu modifizieren,die ansonsten potentiell glycosyliert werden, um so die Glycosylierungzu verringern oder zu beseitigen.
Humanisierter Antikörper vonverringerter Immunogenizität – Dies betriffteinen humanisierten Antikörper,der eine verringerte Immunogenizität relativ zu dem parenteralenAntikörperzeigt, z. B. ein humanisierter Antikörper, der in Bezug auf NR-LU-13humanisierte NRX451-schwere und humanisierte NRX451-leichte Sequenzenenthält.
Humanisierter Antikörper derim wesentlichen die Bindungseigenschaften des parenteralen Antikörpers beibehält – Dies betriffteinen humanisierten Antikörper,der die Fähigkeitbeibehält,spezifisch das Antigen zu binden, das durch den parenteralen Antikörper erkanntwird, der dazu verwendet wurde, um solch einen humanisierten Antikörper herzustellen.Zum Beispiel binden humanisierte Antikörper, die im wesentlichen die Bindungseigenschaftenvon NR-LU-13 beibehalten, spezifisch an ein ungefähr 40 KilodaltonProtein, das durch viele Karzinome exprimiert wird, und weiter bevorzugtan dasselbe Epitop, wie NR-LU-13. Bevorzugterweise wird der humanisierteAntikörperdieselbe oder im wesentlichen dieselbe Antigen-bindende Affinität aufweisen,wie der parenterale Antikörper.Im allgemeinen wird die Affinitätinnerhalb derselben Größenordnung liegen,wie die Affinitätdes parenteralen Antikörpers.Verfahren zur Bestimmung der Antigen-bindenden Affinität sind imStand der Technik gut bekannt und schließen halb-maximale Bindungstests,Kompetitionstests und Scatchard-Analysen ein.
Wo anwendbar, schließen dieangegebenen Definitionen funktionelle Äquivalente ein, d. h. Moleküle die inihrer Länge,Struktur, Komponenten usw. unterschiedlich sind, die jedoch in derLage sind, eine oder mehrere der Funktionen der definierten Moleküle durchzuführen oderzu erreichen. Funktionelle Äquivalente deroben genannten definierten Moleküleschließen funktionelle Äquivalentevon Antikörpernoder Antikörper-Fragmentender vorliegenden Erfindung ein. Ein funktionelles Äquivalentist eine „mimetische\" Verbindung, d. h.ein organisches chemisches Konstrukt, das so aufgebaut ist, um diegeeignete Konfiguration und/oder Orientierung zur Antigen-Bindungnachzuahmen. Ein anderes funktionelles Äquivalent ist ein kurzes Polypeptid,das als ein „minimales\" Polypeptid bezeichnetwird, das unter der Verwendung von Compuer-unterstütztem molekularenModeling konstruiert wurde und Mutanten, die eine veränderte Bindungsaffinität aufweisen,wobei minimale Polypeptide die Antigen-bindende Affinität des Antikörpers zeigen.
Wie oben angegeben, ist die vorliegendeErfindung in Richtung auf die Herstellung von humanisierten Antikörpern undAntigen-bindenden Fragmenten davon, die von NR-LU-13 oder anderennicht-menschlichen Antikörpernabgeleitet sind, die das durch. NR-LU-13 erkannte Antigen binden(an demselben oder verschiedenen Epitopen), und deren Verwendung,insbesondere in zwei-Schritt- und drei-Schritt-Pretargeting-Verfahren,gerichtet. Darüberhinaus, unter der Annahme, daß diebetroffenen humanisierten Antikörpertypischerweise menschliche konstante Regionen enthalten werden,könnensie auch als therapeutische Antikörper verwendet werden. Spezifischrufen humanisierte Antikörper,die humanen konstanten Regionen enthalten, typischerweise menschlicheEffektor-Funktionen hervor, z. B. eine Komplement-vermittelte Cytotoxizitäts-(C\'MC)- und Antikörper-vermittelteZell-Cytotoxizitäts-(ADCC)-Aktivität. SolcheAktivitätkann zur direkten Tumorzell-Lyse durch Komplementproteine oder durchADCC-Effektorzellen, NK-polymorphornuklearen Zellen und Monozytenführen.Auch kann solch eine Aktivitätzu der Induktion einer entzündlichenAntwort führen,wie durch die Infiltration von inflammatorischen Effektorzellen,Makrophagen und polymorphonuklearen Leukozyten typisiert. Daherkönnendiese humanisierten Antikörpereine Tumorzell-Lyse ohne den Bedarf für die Anbringung an ein anderesaktives Mittel, z. B. ein Radionuklid oder ein Toxin, verstärken.
Alternativ können humanisierte Antikörper undAntigen-bindende Fragmente mit oder ohne Effektorsequenzen an aktiveMittel angebracht werden, um eine gewünschte therapeutische Funktionzu bewirken.
Wie vorher beschrieben, ist NR-LU-13ein chimärerAntikörper,der Maus-Fv-Sequenzen und menschliche konstante Domänensequenzenenthält.NR-LU-13 ist ein Antikörper,der das NR-LU-13-Antigen an demselben Epitop wie NR-LU-10 bindet.NR-LU-10 ist ein Pankarzinom-Antikörper, der ein Maus-monoklonalerAntikörperdes IgG2b-Isotyps ist, der ein Molekulargewicht von 150 Kilodaltonaufweist. Wie diskutiert, wurde dieser monoklonale Antikörper, sowiedas Fab-Fragment davon, in klinischen Versuchen an viele hundertMenschen sicher verabreicht.
Radioimmuntests, Immunpräzipitationund Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sorting(FACS)-Analyse wurde dazu verwendet, um Reaktivitätsprofilevon NR-LU-10 zu bestimmen. Das NR-LU-10-Target-Antigen ist entwederauf fixierten Kulturzellen oder in Detergenzextrakten von verschiedenenTypen von Krebszellen vorhanden. Zum Beispiel wird das NR-LU-10-Antigen durch kleine-Zellen-Lungen-,nicht-kleine-Zellen-Lungen-, Colon-, Brust-, Nieren-, Eierstock-,Pankreas- und anderen Karzinomgeweben exprimiert. Die Tumorreaktivität des NR-LU-10-Antikörpers wirdin Tabelle A angegeben, währenddie NR-LU-10-Reaktivitätmit normalen Geweben in Tabelle B angegeben ist. Die Werte in TabelleB wurden wie im folgenden beschrieben erhalten. Positive NR-LU-10Gewebereaktivitätzeigt die NR-LU-10-Antigen-Expressiondurch das Gewebe an. Das NR-LU-10-Antigen wurde durch Varki et al., „AntigensAssociated with a Human Lung Adenocarcinoma Definded by MonoclonalAntibodies\", CancerResearch 44: 681–687(1984), und Okabe et al., „MonoclonalAntibodies to Surface Antigens of Small Cell Carcinoma of the Lung,\" Cancer Research44: 5273–5278(1984) genauer beschrieben.
Die Gewebeproben wurden in Übereinstimmungmit drei Reaktivitätsparameternbewertet: (1) der Intensitätder Reaktion; (2) der Gleichmäßigkeitder Reaktion innerhalb des Zelltyps und (3) dem Prozentsatz vonZellen, die mit dem Antikörperreaktiv waren. Diese drei Werte wurden in einem einzigen gewichtetenVergleichswert zwischen 0 und 500 kombiniert, wobei 500 die intensivsteReaktivitätist. Dieser Vergleichswert erleichtert den Vergleich von verschiedenenGeweben. Tabelle B schließteinen zusammengefaßtenReaktivitätswert,die Zahl von untersuchten Gewebeproben und die Zahl von Proben ein,die mit NR-LU-10 positiv reagierten.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, diean Epitope des NR-LU-10-Antigens binden, sind ebenfalls bekanntund sind in U.S.-Patent Nr. 5,084,396 beschrieben. Kurz gesagt,könnensolche Antikörperdurch das folgende Verfahren hergestellt werden: – Absorbiereneines ersten monoklonalen Antikörpers,der gegen ein erstes Epitop eines polyvalenten Antigens gerichtetist auf einer inerten unlöslichenMatrix, die in der Lage ist, Immunglobulin zu binden, wodurch einImmunsorbent gebildet wird;– Kombinierendes Immunsorbents mit einem Extrakt, der polyvalentes NR-LU-10-Antigen enthält, Bilden einesungelöstenImmunkomplexes, worin das erste Epitop durch den ersten monoklonalenAntikörper maskiertwird;– Immunisiereneines Tiers mit dem unlöslichenImmunkomplex;– Fursionierenvon Milzzellen aus dem immunisiertem Tier mit Myelomzellen, um einHybridom zu bilden, das in der Lage ist, einen zweiten monoklonalenAntikörperherzustellen, der gegen ein zweites Epitop des polyvalenten Antigensgerichtet ist;– Kultivierendes Hybridoms, um den zweiten monoklonalen Antikörper herzustellen; und– Sammelndes zweiten monoklonalen Antikörpersals ein Produkt des Hybridoms.
Monoklonale Antikörper NR-LU-01, NR-LU-02, NR-LU-03und NR-LU-06, die in Übereinstimmungmit den in dem oben genannten Patent beschrieben Verfahren hergestelltwurden, sind beispielhafte Antikörper, diedasselbe Krebsantigen binden, wie NR-LU-10, die zur Verwendung inPretargeting-Verfahren geeignet sind.
Zusätzliche Antikörper, diemit dem NR-LU-10-Antigen reaktiv sind, können auch durch Standardhybridomproduktionund Screening-Verfahren präpariertwerden. Jeder so produzierte und indentifizierte Hybridomklon kannwie oben beschrieben weiter gescreent werden, um die Antigen- undGewebereaktivitätzu verifizieren.
TABELLEAJedoch, während der NR-LU-13-Antikörper undandere Antikörpernicht-menschlichen Ursprungs, die das NR-LU-10-Antigen binden, einetherapeutische und diagnostische Verwendung insbesondere als Targeting-Gruppenin Pretargeting-Verfahren besitzen, leiden sie an einem potentiellenNachteil. Besonders weil sie nicht-menschliche (z. B. Maus-) Sequenzenenthalten, könnensie in Menschen immunogen sein. Dies ist nachteilhaft, da dieseImmunogenizitätdie Targeting-Effizienz nach wiederholter Verabreichung von Antikörper verringernkann.
Daher stellt die vorliegende ErfindungTargeting-Gruppen zur Verfügung,die im wesentlichen dieselbe Antigen-bindenden Eigenschaften wieNR-LU-13 aufweisen, die jedoch eine verringern Immunogenizität aufweisen.Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung humanisierte Antikörper undAntigen-bindende humanisierte Antikörper-Fragmente zur Verfügung, die von NR-LU-13 oderanderen nicht-menschlichen Antikörpernabgeleitet sind, die spezifisch dasselbe durch NR-LU-13 erkannteKrebsantigen und weiter bevorzugt dasselbe Epitop binden. Wie hierverwendet, bedeutet ein humanisierter Antikörper oder humanisiertes Antikörper-Fragmentdas an das durch den AntikörperNR-LU-13 gebundene Antigen „spezifischbindet\", daß der Antikörper oderder das Antikörper-Fragmenteine Bindungsaffinitätvon mindestens ungefähr104 mol–1 aufweist.Bevorzugterweise ist die Bindungsaffinität mindestens ungefähr 106 M–1 und weiter bevorzugtmindestens ungefähr108 M–1.
Wie diskutiert, wurde in der Literaturberichtet, daß humanisierteAntikörpermöglicherweisevon Maus-Antikörpernabgeleitet werden können,die dieselben oder im wesentlichen einige Antigen-bindende Eigenschaftenzeigen, die jedoch eine verringerte Immunogenizität zeigen.
Humanisierte Antikörper können durcheine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Diese Humanisierungsverfahrenschließenein: (a) Graften von nur nicht-menschlichen CDRs auf menschlichesGerüstund konstante Regionen (z. B., Jones et al., Nature 321: 522–525 (1986)(herkömmlichehumanisierte Antikörper) Verhoeyenet al., Science 239: 1534–1536(1988); und (b) Transplantieren der gesamten nicht-menschlichen variablenDomänen,jedoch Verdecken (Veneering) dieser Domänen durch Ersetzen von exponiertenResten (um die Immunogenizitätzu verringern) (z. B., Padlan, Molec. Immun. 28: 489–498 (1991)(veneered Antikörper).Wie supra angegeben, schließenhumanisierte Antikörperwie hier definiert sowohl herkömmliche \"humanisierte\" als auch \"veneered\" Antikörper ein.
Innerhalb der vorliegenden Erfindungwurde die Auswahl getroffen, NR-LU-13 unter der Verwendung einesHumanisierungsprotokolls zu humanisieren, das eine Serie von Sequenzanalyse-und Molecular-Modeling-Schritten einschließt. Diese Protokoll ist schematischin 1 dargestellt. Imwesentlichen umfaßtes den Vergleich der Sequenzen der Maus schweren und leichten variablenKette mit einer Datenbank von Sequenzen der menschlichen schwerenund leichten variablen Region; Auswahl der am meisten ähnlichenmenschlichen Gerüstsequenzen;Ersetzen von ausgewähltenGerüstresten,basierend auf der Sequenzähnlichkeit;Erzeugung von molekularen Modellen, die den parenteralen Maus- undputativen humanisierten Sequenzen entsprechen; Rückmutieren, um die Reste zumodifizieren von denen angenommen wird, daß sie die Konformation vonKomplementaritätbestimmenden Regionen (CDRs) stören,durch Vergleich mit dem molekularen Modell, das der parenteralenAussequenz entspricht; Konstruieren eines molekularen Modells, basierendauf der modifizierten Sequenz und Vergleich dieses Modells mit derparenteralen Maussequenz. Diese Analyse wird fortgeführt, bisdie Konformation der CDRs in den humanisierten Modell eng mit derCDR-Konformation in dem parenteralen Mausmodell übereinstimmt. Dieses Protokollkann auch dazu verwendet werden, um andere nicht-menschliche (z. B. Maus) Antikörper zuhumanisieren, die fürdas durch NR-LU-13 gebundene Antigen spezifisch sind und weiterbevorzugt Antikörper,die dasselbe Epitop wie NR-LU-13 binden.
Wie genauer zur Humanisierung vonNR-LU-13 ausgeführtwird, wurden DNA-Fragmente, die für den NR-LU-13 Antikörper kodierenkloniert und diese DNA-Fragmente wurden durch bekannte Verfahrensequenziert, wobei die gesamten variablen schweren und leichtenDomäneneingeschlossen wurden, die die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs)und die Gerüstregionen(FRs) einschließen.Die Aminosäuresequenzen,die die Maus variablen schweren und leichten Sequenzen kodieren,wurden mit einer Datenbank von menschlichen Sequenzpaaren (Immunglobulinleichten und schweren Ketten, die von demselben Klon abstammten)verglichen. Die DNA-Sequenzen und abgeleiteten Aminosäuresequenzender klonierten schweren und leichten Kette variablen Regionen vonNR-LU-13 ist in 2 dargestellt.Die füreinen solchen Vergleich verwendeten Immunglobulin-Sequenzdaten wurdenvon Kabat et al., \"Sequencesof Proteins of Immunological Interest,\" U.S. Dept. Health and Human Services,Fifth Ed. 1991, erhalten. Die strukturellen Daten wurden von Bernsteinet al., \"The proteindatabank: A computer based archival file for macromolecular structures,J. Mol. Biol. 112: 535–542(1977), erhalten.
Nach dem Sequenzvergleich wurde dieam meisten identische menschliche Antikörpersequenz ausgewählt, umdas Ausgangsgerüstfür den \"grafted\" Antikörper zurVerfügungzu stellen. Als das am meisten identische Sequenzpaar wurde dasjenigedes Klons R3.5H5G\'CL(Manheimer-Lory et al., J. Exp. Med., 174 (Dez. 1991) 1639–1642) gefunden.Die Sequenz der Ausgangs-Maus-CDRs abgeleitet von NR-LU-13 wurden dannin die ausgewähltemenschliche Gerüststrukturtransferiert. Dieses Verfahren führtezu einer anfänglichenputativ humanisierten Fv-Sequenz. Die anfängliche putativ humanisierteSequenz wurde einer Serie von Mutationen unterzogen, wie vorherbeschrieben.
Die anfängliche putativ humanisierteSequenz wurde dann durch Testen der Sequenz in dreidimensionalenModellen \"verfeinert\". Ein molekularesModell wurde von der Ausgangs-Maussequenzund der anfänglichenhumanisierten Sequenz erstellt. ÄquivalenteRestpositionen in Mausmodell und dem humanisierten Modell wurdenverglichen. Die Reste in dem humanisierten Modell, von denen vorhergesagtwurde, daß siedie Struktur der CDRs störenwürden,wurden \"zurückmutiert\". Ein molekularesModell wurde dann von der modifizierten putativ humanisierten Sequenzerstellt und nochmals mit dem Maus molukularen Modell verglichen. DieserZyklus von putativ humanisierter Sequenz molekularem Modeling und \"Rückmutation\", gefolgt durch Vergleich des sich ergebendenmodifizierten humanisierten Sequenzmodells mit dem Mausmodell wirdwiederholt, bis die Konformation der CDRs in dem humanisierten Modelleng mit der CDR-Konformation des Mausmodells übereinstimmten. Das Humanisierungsprotokollist schematisch in 1 dargestellt.
Unter der Verwendung dieser Methodologiemit variablen schweren und leichten Sequenzen, abgeleitet von NR-LU-13(bezeichnet als NRX451-leichte und NRX451-schwere Sequenzen), wurdenhumanisierte NRX451 schwere und leichte Sequenzen erhalten. Diesehumanisierten leichten und schweren Sequenzen sind jeweils in 3 und 4 angegeben. In beiden dieser Figurensind die variablen schweren oder leichten Gerüstreste, die sich von den parenteralenNRX451 schweren und leichten Sequenzresten unterscheiden, in fettenBuchstaben angegeben.
Es kann nach einer Betrachtung der 3 und 4 gesehen werden, daß die humanisierten variablen schwerenund leichten Sequenzen (bezeichnet als NRX451-schwere und NRX451-leichte Sequenzen)sich von den parenteralen Mausantikörper variablen Sequenzen hauptsächlich ander Basis der Fv-Domänein Richtung des C-Teils des Fab-Fragmentes unterscheiden. Die Numerierungder jeweiligen NRX451-Maus und humanisierten Sequenzen entsprichtder UDB-Numerierung. Von diesen humanisierten variablen schweren undleichten Sequenzen wird vorgesehen, daß sie zu humanisierten Antikörpern führen, dieweniger Immunogenizitätaufweisen, als NR-LU-13.
Währendes vorgesehen ist, daß dieNRX451-Sequenzen (unter Berücksichtigungihrer Sequenzähnlichkeitzu menschlichen Immunglobulinen), die in 3 und 4 dargestelltsind, zu Antikörpernführen,die eine verringerte Immungenizität in Menschen (verglichen zuMaus-NR-LU-10 oder chimäremNR-LU-13) hervorrufen und darüberhinaus eine verbesserte Serumhalbwertszeit zeigen können, liegenandere Modifikationen der oben angegebenen NRX451-Sequenzen innerhalbdes Bereichs der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel können diesehumanisierten Sequenzen weiter durch Deletions-, Additions- oderSubstitutionsmutation verändertwerden. Insbesondere könnensie durch die Substitution von einen oder mehreren exponierten Gerüstrestengemäß des Verfahrensvon Padlan, Molec. Immunol. 28: 489–498 (1991), auf das hier Bezuggenommen wird, modifiziert werden. Zum Beispiel ist ein für die Substitutionvorgesehener besonderer Aminosäurerest dasCystein an Position 60 der schweren Kette durch eine andere Aminosäure, zumBeispiel Serin.
Insbesondere umfaßt die Erfindung Substitutionsmodifikationen,die die Antigenbindung nicht wesentlich negativ beeinträchtigen.Zum Beispiel schließtdies konservative Aminosäuresubstitutionenein, z. B. die Substitution einer sauren Aminosäure durch eine andere saureAminosäure.Konservative Aminosäure-Substitutionsmutationensind im Stand der Technik gut bekannt.
Darüber hinaus umfaßt die Erfindungspezifisch NRX451-schwere und NRX451-leichte Sequenzen und Fragmentedavon, die in pNRX451 enthalten sind, das ein Plasmid ist. Ein Plasmidvon NRX451 (pNRX451) ist ein Säugerexpressionsvektor,abgeleitet von pcDNA3 (Invitrogen), der eine cDNA enthält, die für humanisierteschwere und leichte Ketten kodiert.
Auch können diese durch die Deletionvon einer oder mehreren Aminosäurerestenverkürztwerden, um funktionelle (Antigen-bindende) humanisierten Sequenzenherzustellen. Zum Beispiel wurde während der Expression der betreffendenhumanisierten Antikörperin CHO- und Insektenzellenbeobachtet, daß Fragmente(die offensichtlich aufgrund eines zellulären Spaltmechanismus oder desAufreinigungsverfahrens hergestellt wurden), denen Reste der betroffenenhumanisierten NRX451-Sequenzen fehlen, funktionell sind, d. h. siebinden immer noch das NR-LU-13-Antigen. Insbesondere wird beobachtet,daß humanisierteFv-Sequenzen, diedie oben genannten humanisierten Sequenzen enthalten, denen jedochdie ersten sieben N-terminalen Reste NRX451 humanisierter schwereKettensequenz fehlen, funktionell sind. Basierend auf diesen Ergebnissenwird erwartet, daß andereDeletionen, z. B. andere N-terminale und C-terminale Deletionender betroffenen humanisierten NRX451 auch funktionell sein sollten(Antigen binden). Funktionelle Deletionen können durch die aufeinanderfolgende Expression von verschiedenen Deletionen und Screenen dersich ergebenden Deletion, um deren Fähigkeit zu bestimmen, das NR-LU-13-Antigenzu binden, identifiziert werden. Wie unten beschrieben, können mutierteAntikörpersequenzenin jeder einer Vielzahl von Wirtssystemen exprimiert werden, z.B. Säugerzellen(wie zum Beispiel CHO-Zellen, Insekten, Pflanzenzellen, transgenenPflanzen und transgenen Tieren). Wie oben angegeben, betrifft dievorliegende Erfindung weiterhin die Modifikation von Antikörpern (insbesondereder IgG-Klasse), um die N-verbundene Glycosylierung zu eliminieren(d. h. prä-Expressionsmodifikationvon Antikörpern,um die N-verbundene Glycosylierung zu verhindern) oder die N-verbundeneGlycosylierung zu modifizieren (d. h. post-Expressionsmodifikation von N-verbundenerGlycosylierung von Antikörpern).Wie hier beschrieben, weist die Eliminierung oder Modifikation vonN-verbundene Glycosylierung die vorteilhafte Eigenschaft der Verringerungder Immunogenizitätund/oder Toxizitätauf. Antikörpersind Glycoproteine, die an charakteristischen Stellen in Abhängigkeitvon ihrem Isotyp glycosyliert werden. Zum Beispiel werden die IgGsals ein biantennärerKomplex an dem Asn-Xaa-Ser(Thr)-Motiv in jeder der CH2-Domänen (wobeiin diesem Motiv Xaa jede Aminosäureist und Ser und Thr austauschbar sind) N-verbunden glycosyliert.Die Glycosylierung tritt als ein posttranslationales Ereignis auf,wenn Oligosaccharide, die in ihrer Größe von 8 bis 90 Saccharidenreichen, an das Motiv am Asn-Rest (297) N-verbunden werden.
Die Effekte der Glycosylierung aufdie Tertiärstrukturvon Antikörpernund insbesondere der Fc-Region davon ist als strukturell signifikantbekannt. Zum Beispiel wurde eine solche Signifikanz durch NMR-Untersuchungenaufgezeigt (siehe, R. A. Dwek et al. J. Anat. 187: 279–292 (1995), \"Glycobiology: Thefunction of sugar in the IgG molecule\"). Darüberhinaus ist die Glycosylierungsignifikant, da die C1q-Bindung und die Antikörperbindung an Monocyten inglycosylierten monoklonalen Antikörpern signifikant verringertist.
Auch wurde von der Modifikation vonGlycosylierungsmustern in IgG berichtet, daß diese mit vielen Erkrankungenassoziiert sind, einschließlichrheumatoider Arthritis, Alterung und Schwangerschaft (siehe, Dweket al., Ibid). Konsequenterweise führte die Glycosylierung beider kommerziellen Herstellung von monoklonalen Antikörpern kürzlich zuBedenken. Genauer gesagt, führtenungeeignete Glycosylierungsmuster zu Bedenken, da sich die monoklonaleAntikörperproduktionauf den Einschluß vonneuen Organismen ausdehnte, von denen viele Proteine im Vergleichzu menschlichen Zellen unterschiedlich glycosylieren. Früher wurden monoklonaleAntikörpernur in Säugerzellenexprimiert. Jedoch könnenaufgrund der Entwicklung von neuen und verbesserten Vektorsystemen,Proteinreinigung und Kulturverfahren Antikörper, z. B. Maus, chimäre und humanisierteAntikörperin vielen Wirten und Wirtszellsytemen exprimiert werden, z. B. Säugetier-,Hefe-, Insekten- und Pflanzenzellen. Während dies signifikante Vorteilebietet, z. B. stellen Insekten typischerweise eine hohe Expressionvon rekombinanten Proteinen zur Verfügung, besteht mindestens einpotentielles Problem bei der Expression von Proteinen in verschiedenenWirten. Genauer gesagt, währenddie Genauigkeit der Proteinexpression in verschiedenen Wirten gutkontrolliert wird, ist die posttranslationale Modifikation eine inhärente Eigenschaftder einschlägigenZellinie. Im allgemeinen glycosylieren Wirtszellen Proteine aufeine charakteristische Weise, d. h. einem Glycosylierungsmuster.
Von dem posttranslationalen Verfahrender Glycosylierung in neuen Expressionssystemen wurde geglaubt,daß siebesonders problematisch sind, da sie die Bioverteilung des sichergebenden Glycoproteins aufgrund von veränderter Kohlenhydraterkennungbeeinträchtigenkönnten.In dieser Hinsicht ist weit akzeptiert, daß Oligosaccharide als Erkennungselementefungieren. Zum Beispiel weise viele tierische Proteine, die aus Zellenund Geweben isoliert wurden, Sequenzmotive auf, die Kohlenhydratdomänen erkennen.Daher würde vonder Modifikation von Glycosylierungsstellen erwartet, daß sie dieBioverteilung eines Proteins verändern.
Darüber hinaus, weil die Oligosaccharidedie Antikörperstrukturverändern,kann von der Modifikation von Glycosylierungsstellen möglicherweiseerwartet werden, daß siepotentiell die Struktur und die Bindungskonformation des Antikörpermoleküls negativbeeinträchtigen.
Jedoch, wie in der Beschreibung dervorliegenden Erfindung gezeigt, wurde es entdeckt, daß die Beseitigungoder Modifikation der Kohlenhydratgruppen von Antikörpern (insbesonderehumanisierten Antikörperngegen das NR-LU-13-Antigen) eher vorteilhafte als nachteilhafteEffekte aufwies.
Um die Immunogenizität oder Toxizität von IgG-KlasseAntikörpernzu verringern oder zu beseitigen, stellt die vorliegende Erfindungeine prä-Expressions-oder post-Expressionsmodifikationvon Antikörpernzur Verfügung,um eine N-verbundene Glycosylierung zu verhindern oder zu modifizieren.Die Beseitigung von potentiellen Glycosylierungsstellen in monoklonalenAntikörpern,z. B. chimärenund humanisierten Antikörpern undFragmenten davon, kann durch Orts-spezifische Mutagenese erreichtwerden. Genauer gesagt, schließt dievorliegende Erfindung eine Orts-spezifische Mutagenisierung vonDNA-Sequenzen ein, die fürAntikörper oderAntikörperfragmentekodieren, bevorzugterweise humanisierte Antikörper oder humanisierte variableSequenzen, die Substitutionsmutationen in oder nahe einer oder mehrereGlycosylierungsstellen einführt.
Dies wird durch Orts-spezifischeMutagenese eines Kodons in einer DNA erreicht, die für eine Immunoglobulinsequenzkodiert, die einem Aminosäurerestentspricht, der innerhalb einer Glycosylierungsstelle enthaltenist oder der ausreichend nahe dazu ist, so daß die Modifikation einer solchenAminosäurezur Beseitigung der Glycosylierung an der Glycosylierungsstelleführt.Im allgemeinen wird dies eine Orts-spezifische Mutagenese der Asn-Xaa-Ser(Thr)-Glycosylierungsmotiveeinschließen,die im Immunglobulin vorhanden sind. Zum Beispiel ist von solchenAsn-Xaa-Ser(Thr)-Motiven bekannt, daß sie in der CH2-Domäne von IgGs ankonservierten Stellen in dem Antikörpermolekül vorhanden sind.
Die Beseitigung der Glycosylierungan solchen Stellen/solcher Stelle wird durch Orts-spezifische Mutageneseeiner Glycosylierungsstelle erreicht, die in einer Antikörpersequenzenthalten ist, um eine oder mehrere der Aminosäuren, die darin enthalten sind,zu verändern(zu substituieren oder zu deletieren) und dadurch die Glycosylierungan solcher Stelle zu verhindern. Verfahren zur Einführung vonOrts-spezifischen Mutationen in DNA-Sequenzen an einer gewünschtenStelle sind im Stand der Technik gut bekannt.
Im allgemeinen wird daher das Verfahrendas Klonieren einer DNA-Sequenz, die für einen gewünschten Antikörper kodiert,umfassen, Identifizieren der darin enthaltenen Glycosylierungsmotiveund Modifizieren eines oder mehrerer Kodons in den Glycosylierungsmotivenum so eine Aminosäuresubstitutionsmutationeinzuführen,so daß nachder Expression einer solchen DNA in einer ausgewählten Wirtszelle der erhalteneAntikörpernicht an der Stelle glycosyliert ist.
Wie angegeben, sind Verfahren zurOrts-spezifischen Mutagenese im Stand der Technik gut bekannt. Beider Orts-gerichteten Mutagenese wird die Substitution durch diechemische Synthese eines Oligonukleotids, das den gewünschtenBasenaustausch enthält,hybridisieren des Oligonukleotids an die DNA, die für die zu änderndeSequenz kodiert und Verlängerndes falsch gepaarten Primers mit einer DNA-Polymerase um die neueGensequenz zu erzeugen, erreicht. Das mutierte Gen kann anschließend ineinen geeigneten Wirtsorganismus oder Expressionssystem eingeführt werden,um die Mutanten-DNA oder -RNA zu ergeben oder das veränderte Proteinproduktherzustellten. Typischerweise wird eine solche Modifikation denAsparaginrest in einem Glycosylierungsmotiv durch eine andere Aminosäure substituieren.
Alternativ kann ein Glycosylierungsmotivdurch Deletion des DNA-Kodons fürentweder Asparagin oder Serin/Threonin in der Sequenz Asn-Xaa-Ser/Thrverändertwerden, was ein Auftreten der Glycosylierung an dieser Stelle verhindernwürde.Zum Beispiel könnenDNA-Sequenzen zwischenzwei einmalig auftretenden Restriktionsstellen, die die Glycosylierungsstelleflankieren, ohne das Asparaginkodon chemisch synthetisiert werden.Die Ausgangs-Wildtyp-DNA-Sequenz kann dann durch die veränderte Sequenzin dem Plasmidkonstrukt unter der Verwendung der zwei Restriktionsstellenersetzt werden.
Zum Beispiel umfaßt ein Mittel die Synthesevon zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die die Zielsequenz überlappen,die modifiziert werden soll, d. h. den Teil der DNA, der für das Asn-Xaa-Ser(Thr)-Motivkodiert, von denen eine die Mutation enthält, die eingeführt werdensoll; Durchführenvon zwei getrennten Polymerase-Kettenreaktionen, wobei in der erstenReaktion das Mutanten-Oligonukleotid amplifiziert wird; und Durchführen einerzweiten Polymerase-Kettenreaktion, wobei eine PCR \"Nähreaktion\" durchgeführt wird. Dies führt im wesentlichenzur Kombination des mutierten Oligonukleotids mit dem zweiten Oligonukleotidprimer, umeine einzige Mutanten cDNA zu erzeugen, die die gewünschte Mutationenthält.Die amplifizierte cDNA, die die Mutation enthält, wird dann in die geeigneteInsertionsstelle in einen Vektor eingeführt, der die Ausgangs-(nicht-mutierte)-Antikörper-DNA-Sequenzenthält.Die erhaltenen Klone werden dann sequenziert, um sicherzustellen,daß dieMutation an der geeigneten Stelle eingeführt wurde.
Mutationen von Glycosylierungsstellenkönnenin jede klonierte Antikörpersequenz,z. B. Maus-Antikörpersequenzen,chimäreAntikörpersequenzenund humanisierte Antikörpersequenzeneingeführtwerden. Die erhaltenen mutierten Antikörper-DNA-Sequenzen werden dann in einem gewünschtenExpressionssystem exprimiert, um Antikörper zu erhalten, die eineverringerte oder keine Glycosylierung aufweisen.
Alternativ kann die N-verbundeneGlycosylierung (gegebenenfalls die O-verbundene Glycosylierung) einesIgG-Antikörperspost-Expression modifiziert werden. Es liegt weiter innerhalb desBereichs der vorliegenden Erfindung, einen Antikörper (oder Fragment) sowohlprä-Expressionund post-Expression zu modifizieren. Die Modifikation post-Expressionbedeutet ein Beseitigen oder Modifizieren (z. B. ein Verringern)der N-verbundenen Glycosylierung post-Expression. Post-Expressionsmodifikationenschließenein: die Expression von Antikörpersequenzenin Wirtssystemen (Expressionssystem) die einen Antikörper oderein Antikörperfragmentnicht N-verbunden Glycosylieren; chemische Modifikation und enzymatischeModifikation. Wirtssysteme werden genauer unten diskutiert. DieGlycosylierungsstellen auf einem Antikörper können enzymatisch entfernt werden.Es gibt eine Zahl von Glycosidasen, die in der Lage sind, die Kohlenhydrateauf Proteinmolekülenabzuspalten. Beispiele von solchen N-Glycosidasen, die herkömmlich für die Deglycosylierungvon N-verbundenen Kohlenhydraten verwendet werden, schließen ein:N-Glycosidase H, die Hoch-Mannosetyp- und Hybridoligosaccharidkettenspaltet; Endoglycosidase F, die biantennäre Komplextyp-Oligosaccharide spaltetund Peptid N-GlycosidaseF, die tri- und tetraantennäreKomplextypketten sowie andere spaltet, die durch die oben beschriebenenN-Glycosidasen gespalten werden. O-verbundene Kohlenwasserstoffekönnen auchenzymatisch unter der Verwendung von O-Glycanase und ähnlichenentfernt werden. Glycosidasen sind käuflich erhältlich (z. B. Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO). Diese Enzyme und andere, die dem Fachmann imStand der Technik bekannt sind, sind in der Lage, einige der angegebenenKohlenhydrate unter der Verwendung von milden Reaktionsbedingungenzwischen pH 4,0 und 9,0 zu entfernen. Zum Beispiel ist PNGase Fam meisten aktiv bei pH 8,0, wird jedoch geeignet bei ±± einempH-Wert funktionieren.
Die chemische Modifikationsmethodologieder vorliegenden Erfindung zur Modifizierung von Antikörpern umso die Immunogenizitätund/oder Toxizitätzu verringern, ist eine Oxidation, die gegebenenfalls von einemReduktionsschritt gefolgt werden kann. Die Oxidation von Kohlenhydratenauf dem Antikörpererzeugt Aldehydgruppen, die zu ihren entsprechenden Alkoholen reduziertwerden können.Das Verfahren schließtdie Verwendung eines mild oxidierenden Mittels, wie zum BeispielNatriummetaperjodat, gefolgt von Reduktion mit einem mild reduzierendenMittel, wie zum Beispiel Natriumborhydrid ein. In dem Oxidationsverfahrenkönnen Thioetheroder Thioether-enthaltende Verbindungen, wie zum Beispiel Methioningegebenenfalls zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt werden, um Oxidations-sensitiveAminosäurenin der Komplement-bestimmenden Region des Antikörpers zu schützen. AnderewasserlöslicheThioester könntenauch fürdenselben Zweck verwendet werden. Es wird für einen Fachmann im Stand derTechnik ersichtlich sein, daß dieVerwendung solch einer Verbindung für den bestimmten Antikörper, deroxidiert wird, optimiert werden kann. Auch kann die Molarität der Oxidations-und Reduktionsmittel sowie andere Reaktionsparameter, die in demVerfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, für jedenAntikörperoptimiert werden.
Andere Verfahren können beider Handhabung (z. B. Stabilisierung) der reaktiven Aldehyde, diedurch oxidierende Mittel erzeugt werden, verwendet werden. Zum Beispiel,wenn der Reduktionsschritt nach der Oxidation ausgelassen wird,könntenAldehyde zu den entsprechenden Carbonsäuren oxidiert werden. Diese Überführung isteine einfache Reaktion und kann in dieser Verwendung einer Vielzahlvon milden Oxidationsmitteln, zum Beispiel Sauerstoff, Wasserstoffperoxid,N-Bromsuccinimid, Silberoxid; Natriumpermanganat und ähnlichenerreicht werden. Eine noch andere Methodologie schließt die Schützung vonAldehyden ein, um sie inaktiv gegenüber allen anderen Funktionalitäten zu machen,die innerhalb des Antikörpersvorhanden sind. SchützendeMittel schließenHydroxylamine, wie zum Beispiel Carbomethoxyamin oder Hydrazidderivatewie zum Beispiel Essighydrazid und Methylhydrazino-Carboxylat ein.Die Reaktion von jeder dieser zwei Klassen von schützendenMitteln führtzur Bildung von stabilen Addukten. Ein anderes Verfahren schließt die Überführung desAldehyds zu einem stabilen Amin durch reduktive Alkylierung miteinem primärenAmin (z. B. Glyzin) und Natriumcyanoborhydrid ein. Alle der obenangegebenen Mittel sind käuflicherhältlich(z. B. Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI and Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO), und Verfahren zu deren Verwendung sind dem Fachmannbekannt.
In einer Ausführungsform der vorliegendenErfindung inaktivierte die Oxidation der Kohlenhydrate auf NRX451unter der Verwendung von Natriummetaperjodat (NaJO4),gefolgt von der Reduktion mit Natriumborhydrid (NaBH4)erfolgreich die Komplementvermittelte Cytotoxizitäts-(C\'MC)-Aktivität des Antikörpers, ohne eineBeeinträchtigungder Antikörper-abhängigen zellulären Cytotoxizitäts-(ADCC)-Aktivität. Zum Beispielwird N-Acetyl-D-glucosamin(GlcNac) zwischen Kohlenstoffen 3 und 4 zu entsprechenden Aldehydgruppenoxidiert. In dieser Ausführungsformwurde Methionin zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, um Oxidations-empfindlicheAminosäurenin der Komplement-bestimmenden Region des Antikörpers zu schützen. Eswurde früherin der Literatur berichtet (Awwad et al., Cancer Immunol. Immunother.38: 23–30(1994)), daß dieOxidation mit NaJO4 nicht die C\'MC-Aktivität einesmonoklonalen Antikörpersverändert.Jedoch wurde überraschenderweiseund vorteilhafterweise wie hier beschrieben entdeckt, daß das Oxidations-/Reduktionsverfahrender vorliegenden Erfindung die C\'MC-Aktivität verändert, ohnedie ADCC-Aktivitätzu beeinträchtigen.Das Ausmaß derKohlenhydratmodifikation wurde durch Lectin-Bindungs-ELISA verfolgt.Die C\'MC- und ADCC-Aktivität wurdeunter der Verwendung von in vitro 51Cr-Freisetzungs-Cytotoxizitätstestsgemessen, die gut im Stand der Technik bekannt sind.
Der in CHO-Zellen produzierte Antikörper NRX451zeigte eine Toxizität,wenn an menschliche Patienten in einem Phase I klinischen Versuchverabreicht. Es wurde in in vitro-Analysen bestimmt, daß der bestimmteAntikörperADCC und C\'MC-Aktivität aufwies.Auch war dieser monoklonale Antikörper mit Antigenen, die imDarm von Menschen lokalisiert sind kreuzreaktiv, was der Grund derToxizitätsein kann, zusätzlichzur Reaktivitätan Tumorstellen. Daher beschreibt die vorliegende Erfindung diechemische Modifikation der Kohlenhydrate, die eine C\'MC-Aktivität und diein Patienten gezeigte Toxizitätentfernt. Die Ergebnisse von klinischen Untersuchungen, aus derVerwendung des chemisch modifizierten NRX451 führte zu keinen toxischen Effektenin Patienten. Daten von sieben Patienten, die mit dem oxidierten/reduziertenhumanisierten Antikörper NRX451untersucht wurden, zeigen, daß derAntikörpersicher verabreicht werden kann.
Unter der Verwendung der oben beschriebenenMethodologie oder anderen Humanisierungsverfahren, die hier angegebensind, könnenhumanisierten Sequenzen von anderen Antikörpern abgeleitet werden, diegegen das Krebsartigen hergestellt wurden, das durch NR-LU-13 gebundenwird. Solche Antikörperwerden in dem hier erwähntenU.S. Patent Nr. 5,084,396 beispielhaft dargestellt. Diese Antikörper schließen NR-LU-01,NR-LU-02, NR-LU-03und NR-LU-06 und Fragmente davon ein.
Nachdem die humanisierten variablenSequenzen identifiziert sind, werden die entsprechenden DNA-Sequenzensynthetisiert und zur Herstellung von humanisierten Antikörpern verwendet.Wie supra diskutiert, werden diese humanisierten Antikörper bevorzugterweiseeine Antigen-bindende Affinitätfür dasdurch NR-LU-13 gebundene Antigen aufweisen. Im allgemeinen wirddie Bindungsaffinitätvon mindestens ungefähr 104 M–1 sein; bevorzugterweisemindestens ungefähr106 M–1 und weiter bevorzugtmindestens ungefähr108 M–1. Tests zur Bestimmungder Affinitätvon Antikörpernfür einAntigen sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen beispielhafthalb-optimale Bindungstests, Kompetitionstests und Scatchard-Analysenein.
Die humanisierten Antikörper werdendurch die Expression der humanisierten variablen schweren und leichtenKetten in einem geeigneten Wirtssystem erhalten. Im wesentlichen,wie hier verwendet, betrifft ein geeignetes \"Wirtssystem\" jedes Expressionssystem, einschließlich Wirtszellgewebeoder multizellulärenOrganismus und Vektor oder Vektoren, die Nukleinsäuresequenzenenthalten, die fürdie vorliegenden humanisierten Antikörper oder Fragmente kodieren,die in Kombination eine Expression von funktionellen Antikörpern zur Verfügung stellen,d. h. die die humanisierten schweren und leichten Ketten assoziiert,um die charakteristische Antigen-bindende Struktur herzustellen.
Die folgenden Referenzen sind für Verfahrenund Wirtssysteme beispielhaft, die für die Expression von rekombinantenImmunoglobulinen geeignet sind: Weidle et al., Gene 51: 21-29 (1987); Doraiet al., J. Immunol. 13(12): 4232–4241 (1987); De Waele et al.,Eur. J. Biochem. 176: 287–295(1988); Colcher et al., Cancer Res. 49: 1738–1745 (1989); Wood et al.,J. Immunol. 145(a): 3011–3016(1990); Bulens et al., Eur. J. Biochem. 195: 235–242 (1991); Beggington etal., Biol. Technology 10: 169 (1992); King et al., Biochem. J. 281:317–323 (1992);Page et al., Biol. Technology 9: 64 (1991); King et al., Biochem.J. 290: 723–729(1993); Chaudary et al., Nature 339: 394–397 (1989); Jones et al.,Nature 321: 522–525(1986); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44: 65–92 (1988); Benhar et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12051–12055 (1994); Singer et al.,J. Immunol. 150: 2844–2857(1993); Cooto et al., Hybridoma 13(3): 215–219 (1994); Queen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029–10033 (1989); Caron et al.,Cancer Res. 32: 6761–6767(1992); Cotoma et al., J. Immunol. Meth. 12: 89–109 (1992).
Expressionswirtssysteme, einschließlich Vektoren,Wirtszellen, Geweben und Organismen, die in der Lage sind, funktionellerekombinante Antikörperherzustellen, und insbesondere humanisierte und chimäre Antikörper, sindim Stand der Technik gut bekannt. Darüber hinaus sind die für die Expressionvon rekombinanten Antikörperngeeignete Wirtssysteme käuflicherhältlich.
Wirtszellen, von denen bekannt ist,das sie in der Lage sind Immunglobuline oder Antikörperfragmente zuexprimieren, schließenbeispielhaft Säugerzellen,wie zum Beispiel Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen, COS-Zellen,Myelomzellen; Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli; Hefezellenwie zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae; Insektenzellen, wie zumBeispiel Spodoptera frugiperda neben anderen Wirtszellen ein. CHO-Zellenwerden von vielen Forschern aufgrund ihrer Fähigkeit verwendet, Immunglobulineeffektiv zu exprimieren und zu sekretieren. Auch sind Insektenzellenwünschenswert,da sie zu einer hohen Expression von rekombinanten Proteinen inder Lage sind.
Die Expression in Insektenzellenoder Insekten wird bevorzugterweise unter der Verwendung eines rekombinantenBaculovirusvektors bewirkt, der in der Lage ist, heterologe Proteine(hier humanisierte Immunglobulinsequenzen) unter der transkriptionellenKontrolle eines Baculovirus Polyhydrin-Promotors zu exprimieren.(z. B. U.S. Patent Nr. 4,745,051, das ein Baculovirus/Insektenzell-Expressionssystembetrifft). Polyhydrin ist ein hoch-exprimiertes Protein, weshalbsein Promotor eine effiziente heterologe Proteinproduktion zur Verfügung stellt.Der bevorzugte Baculovirus ist Autographa californica (ACMNPV).Geeignete Baculovirusvektoren sind von Invitrogen käuflich erhältlich.
Im wesentlichen werden diese Vektorenmodifiziert, z. B. durch homologe Rekombination, um rekombinantenBaculovirus herzustellen, der humanisierte NR-LU-13 variable schwereund leichte Sequenzen enthält,die operativ mit dem Polyhydrinpromotor verbunden sind. Insektenoder Insektenzellen werden dann mit dem rekombinanten Baculovirusinfiziert. Bevorzugterweise wird der Baculovirus in die Zellen derWand des Insektendarms eindringen, zum Kern dieser Zellen wandernund sich replizieren, was zu Ausschlußkörperchen führt, die sich in infiziertenZellen und Geweben ansammeln, die letztendlich das Insekt lysieren.Die exprimierten humanisierten Antikörper werden dann von dem Insektoder den Insektenresten erhalten.
Auch können die betreffenden humanisiertenAntikörperin transgenen Pflanzen oder Tieren exprimiert werden. Die betreffendenhumanisierten Antikörpersequenzenkönnenoperativ mit einem Promotor verbunden werden, der spezifisch inSäugergewebeaktiviert wird, wie zum Beispiel einem Milch-spezifischen Promotor. SolcheVerfahren sind in U.S. Patent Nr. 4,873,316 und U.S. Patent Nr.5,304,498 beschrieben.
Typischerweise werden solche Verfahreneinen Vektor verwenden, der ein Signalpeptid enthält, das dieSekretion einer operativ verbundenen Polypeptidsequenz ermöglicht,einen Milch-spezifischen Promotor, wie zum Beispiel den Caseinpromotor,eine Enhancer-Sequenz und humanisierte Immunglobulinsequenzen spezifischfür dasNR-LU-10-Antigen, z. B. humanisierte Sequenzen, abgeleitet von NR-LU-13.
Dieser Vektor wird in einen geeignetenWirt eingeführt,z. B. Rinder-, Schaf-, Schwein-, Kaninchen-, Ratte-, Frosch- oderMausembryo, typischerweise durch Mikroinjektion unter Bedingungen,bei denen der Expressionsvektor in das Genom des bestimmten Embryosintegriert. Der erhaltene transgene Embryo wird dann in eine Leihmuttertransferiert und die Nachkommen werden gescreent, um diejenigenTransgene zu identifizieren, die die humanisierten Antikörper inihrer Milch enthalten und exprimieren. Transgene, die die Antikörpersequenzenenthalten und/oder exprimieren, können z. B. durch Southern Blot- oder Western Blot-Analyse identifiziertwerden. Die von solchen transgenen Tieren produzierte Milch wirddann gesammelt und daraus humanisierte Antikörper isoliert. Wie angegeben,sind solche Verfahren genau in U.S. Patent Nrn. 4,873,316 und 5,304,498beschrieben.
Die entsprechenden humanisiertenAntikörpersequenzenkönnenauch in Pflanzen exprimiert werden, z. B. transgenen Pflanzen, Pflanzengeweben,Pflanzensamen und Pflanzenzellen. Solche Verfahren sind zum Beispielin U.S. Patent Nr. 5,202,422 beschrieben.
Fürdie Transformation von Pflanzen, Pflanzengeweben und Pflanzenzellengeeignete Expressionsvektoren sind im Stand der Technik bekannt.Im allgemeinen schließensolche Vektoren die DNA von Interesse (hier humanisierte Antikörpersequenzen),einen geeigneten Promotor (typischerweise Pflanzen-, bakterieller oderviraler Promotor) und einen Pflanzen- oder Pflanzenzellen-funktionellen selektierbarenMarker ein. Verfahren zur Einführungvon gewünschtenDNAs in Pflanzen und Pflanzenzellen schließen beispielhaft AgrobakteriumvermittelteTransformation, Protoplastentransformation, Gentransfer in Pollen,Injektion in reproduktive Organe und die Injektion in unreife Embryosein.
Die transformierten Embryos oderPflanzen werden dann dazu verwendet, um Nachkommen durch herkömmlicheVerfahren, z. B. Kreuzung, Rückkreuzung,usw. herzustellen. Nachkommen, die den humanisierten Antikörper exprimieren,werden dann z. B. durch Western Blotting, Zellbindungstests usw.identifiziert. Diese Nachkommen werden dann kultiviert und geerntetund zur Ausbeute von Antikörpernverwendet. Solche Verfahren sind genau in U.S. Patent Nr. 5,202,422und U.S. Patent Nr. 5,004,863 beschrieben. Für die Expression von heterologenProteinen geeignete Pflanzen sind gut bekannt und schließen beispielhaftTomaten-, Tabak-, Mais-, Sojabohnen- und Baumwollpflanzen ein. ZumBeispiel werden die betreffenden humanisierten Antikörper, diegegebenenfalls weiter mutiert werden um Glycosylierungsstellen zuentfernen, in Pflanzenzellen exprimiert, die Antikörper undAntikörperfragmentenicht N-verbunden Glycosylieren und/oder O-verbunden Glycosylieren.
Die rekombinante Expression von funktionellenhumanisierten Antikörpernkann durch eines von zwei allgemeinen Verfahren bewirkt werden.Im ersten Verfahren werden der Wirt oder die Wirtszellen mit einem einzelnenVektor transfiziert, der die Expression von sowohl schweren undleichten variablen Sequenzen zur Verfügung stellt, die an geeignetekonstante Regionen fusioniert sind. Im zweiten Verfahren werdenWirtszellen mit zwei Vektoren transfiziert, die jeweils die Expressionenvon entweder der variablen schweren oder leichten Sequenz, fusioniertan eine geeignete konstante Region, zur Verfügung stellen. Die vorliegendenhumanisierten Sequenzen, abgeleitet von NR-LU-13, werden in geeignetenWirtszellen unter Bedingungen exprimiert, so daß ein funktionelles Antikörperfragment(z. B. Fv) oder gesamter Antikörpererhalten wird. Bevorzugterweise werden solche Sequenzen an geeignetemenschliche konstante Sequenzen, z. B. menschliche schwere oderleichte konstante Sequenzen fusioniert. Die menschlichen konstantenSequenzen sind gut bekannt und wurden in der Literatur beschrieben.Zum Beispiel enthältKabat et al., \"Sequencesof Proteins of Immunological Interest,\" 5th Ed., U.S.Dept. Health HumanServices (1991) solche Sequenzen. Bekannte menschliche konstanteSequenzen, die fürdie Produktion von humanisierten Antikörpern verwendet werden, schließen beispielhaftmenschliches Gamma 1, Gamma 3 und Gamma 4 (menschliche schwere konstanteSequenzen) und Kappa und Lambda (menschliche leichte konstante Sequenzen)ein. Die ausgewähltemenschliche konstante Sequenz beeinträchtigt die Effektorfunktiondes humanisierten Antikörpers.
Bei der Expression von rekombinantenAntikörpernin Zellkultur, z. B. in CHO-Zellen oder Insektenzellen, ist es bevorzugt,die Sekretion des Antikörpersdurch die Wirtszelle zur Verfügungzu stellen. Dies schließt einoperatives Verbinden der DNAs, die für die humanisierten schwerenund leichten Kettensequenzen kodieren, an geeignete Signalpeptidsequenzenein, d. h. diejenigen, die durch die bestimmte Wirtszelle erkanntund prozessiert werden. Signalpeptide sind gut bekannt und erhältlich.Typischerweise wird ein Signalpeptid ausgewählt, das mit der Wirtszelleoder dem exprimierten Protein homolog ist. Zum Beispiel können dieendogenen Signalpeptide von Maus NR-LU-10 verwendet werden. DasExpressionssystem (z. B. der Expressionsvektor) wird bevorzugterweiseSequenzen enthalten, die die Selektion von Transfektanten und dieExpression von humanisierten Antikörpern zur Verfügung stellenwerden. Daher wird bevorzugterweise der Vektor oder die VektorenGene enthalten, die eine Selektion ermöglichen, z. B. Antibiotika-(oder Wirkstoff-) Resistenzgene. Auch wird der Vektor bevorzugterweisePromotoren enthalten, die eine effiziente Expression der schwerenund leichten Ketten zur Verfügungstellen, sowie andere regulatorische Sequenzen, z. B. Polyadenylierungsregionen,Enhancer-Regionen, usw. Der Aufbau von Systemen, die für die Expressionvon rekombinanten Antikörperngeeignet sind, ist gut bekannt und liegt innerhalb des Bereichsdes Durchschnittsfachmanns, wie durch die oben angegebenen Referenzenbelegt, die sich auf die Expression von rekombinanten Immunglobulinen beziehen.
Ein gut bekanntes Beispiel von für die Expressionvon Immunglobulinen geeigneten Wirtszellen sind CHO-Zellen. Beider Expression von Immunglobulinen in CHO-Zellen oder anderen Säugerzellenist es wünschenswert,eine Sequenz einzuschließen,die eine Amplifikation zur Verfügungstellt, um so die Vektorkopienzahl zu erhöhen und die Antikörperausbeutezu erhöhen.Solche Sequenzen schließenbeispielhaft dominante selektierbare Marker, wie zum Beispiel unteranderem Dihydrofolatreduktase (DHFR), Neomycinphosphotransferase(NEO), Glutaminsynthase (GS), Adenosindeaminase (ADA) ein.
Beispiele für geeignete Promotoren, diefür dieExpression von Proteinen in Säugetierzellenbrauchbar sind, schließenbeispielhaft virale Promotoren, wie zum Beispiel den menschlichenCytomegalovirus (CMV) frühenPromotor, SV40 früheund spätePromotoren und den RSV-Promotorund -Enhancer ein. Auch können Säugetierpromotorenverwendet werden, z. B. Immunglobulinpromotoren, Wachstumshormonpromotoren;wie zum Beispiel Rinderwachstumshormonpromotor, usw. Es ist bevorzugt,einen starken Promotor auzuwählen, d.h. einen, der hohe Transkriptionsspiegel zur Verfügung stellt.
Auch wird der Vektor bevorzugterweisePolyadenylierungssequenzen (polyA) Sequenzen enthalten, die einePolyadenylierung von mRNA zur Verfügung stellen, die dazu beiträgt, um diemRNA-Stabilitätzu verbessern und dadurch die Proteinproduktion zu verstärken. Beispielevon geeigneten polyA-Sequenzen schließen beispielhaft unter anderemSV40 polyA-Sequenzen und Rinderwachstumshormonpromotor (BGH) polyA-Sequenzenein.
In einer Ausführungsform der vorliegendenErfindung wurde ausgewählt,die entsprechenden humanisierten Sequenzen in CHO (dhfr)-Zellenzu exprimieren, wobei die Zellen mit einem Vektor transfiziert wurden,der von einem käuflicherhältlichenVektor abgeleitet wurde, der jedoch modifiziert wurde.
Der Plasmidvektor pcDNA3 wurde vonInvitrogen Corp. (San Diego, CA) erhalten. Dieser Vektor enthält zur Zielgenexpressionden menschlichen Cytomegalovirus (hCMV)-Promotor und -Enhancer (Boshartet al., Cell 41: 521–530(1985)), ein Neomycin-Resistenzgen zur Selektion in Säugerzellenund einen prokaryontischen Origin-of-Replication und das Beta-Lactamase-Gen zurVervielfältigungund Selektion in E. coli. Der Vektor pcDNA3 wurde modifiziert, umeinen zweiten hCMV-Promotor und -Enhancer zu enthalten, auch ein DHFR-Gen für die Genamplifikationund zusätzlicheRestriktionsstellen, um die Antikörpergene aufzunehmen.
In einer Ausführungsform wurde es ausgewählt, dieschweren und leichten NRX451 humanisierten variablen Sequenzen anmenschliche γ1und K konstante Regionen zu fusionieren. Jedoch können andere menschlichekonstante Regionen dafürersetzt werden. Die genauen Verfahren, die verwendet wurden, sind imDetail in den Beispielen beschrieben. Darüber hinaus wird erwartet, daß humanisierteAntikörper,die die vorliegenden NXR451 humanisierten schweren und leichtenSequenzen enthalten, unter der Verwendung von anderen konstantenRegionen oder anderen Wirtssystemen exprimiert werden können, diein der Lage sind, funktionelle rekombinante Antikörper zuexprimieren. Insbesondere wird erwartet, daß die vorliegenden humanisiertenAntikörperin transgenen Pflanzen oder Tieren oder in Insekten, wie oben beschrieben,exprimiert werden können.
Nachdem die humanisierten Antikörper exprimiertwerden, werden sie gereinigt und dann auf ihre Fähigkeit hin getestet, Antigenzu binden. Verfahren zur Reinigung von rekombinanten Immunglobulinensind gut bekannt und sind in den hier aufgenommenen Referenzen beschrieben,die sich auf die Produktion von rekombinanten Antikörpern beziehen.Zum Beispiel schließtein gut bekanntes Verfahren zur Reinigung von Antikörpern eineProtein A-Reinigungein, aufgrund der Neigung von Protein A, an die Fc-Region von Antikörpern zu binden.
Die Fähigkeit der vorliegenden humanisiertenAntikörper,Antigen zu binden, wird durch jedes einer Vielzahl von bekanntenVerfahren zum Testen auf Antigen-Antikörper-Affinität bestimmt.Wie diskutiert, bindet der parenterale Mausantikörper NR-LU-13 ein ungefähr 40 KilodaltonGlycoprotein, das auf zahlreichen Karzinomen exprimiert wird. DiesesAntigen wurde in Varki et al., Cancer Res. 44: 681–687 (1984);Okabe et al., Cancer Res. 44: 5273-5278 (1989) charakterisiert, auf dashier Bezug genommen wird. Daher ist es Routine, die Fähigkeitvon humanisierten Antikörperndie gemäß der Erfindunghergestellt wurden zu testen, das NR-LU-13-Antigen zu binden. Darüber hinaussind Verfahren zur Evaluierung der Fähigkeit von Antikörpern, anEpitope dieses Antigens zu binden, bekannt.
In einem Aspekt der Erfindung wären diehumanisierten Antikörper(oder Fragmente davon) der vorliegenden Erfindung brauchbare Werkzeugein Verfahren zur medizinischen Diagnostik und therapeutischen Zwecken.Ein diagnostisches Verfahren oder therapeutisches Verfahren zumNachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Zielstelle innerhalbeines Säugetierwirtswird beschrieben. Bei der Bestimmung der Kriterien zur Anwendungvon humanisierten Antikörpernoder Antikörperkonjugatenfür diein vivo-Verabreichung für therapeutischeZwecke ist es wünschenswert,daß dasallgemein erreichbare Zielverhältnishoch ist und das die absolute Dosis von therapeutischem Mittel,das dem Tumor zugeführtwird ausreichend ist, um eine signifikante Tumorantwort hervorzurufen.Verfahren zur Verwendung der humanisierten Antikörper, die in der vorliegendenErfindung beschrieben werden, könnenzum Beispiel in den U.S. Patenten Nrn. 4,877,868, 5,175,343, 5,213,787,5,120,526 und 5,202,169 gefunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsformder Erfindung wird ein Antikörperkonjugatoder eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Pretargeting-Verfahrenverwendet. Im wesentlichen sind solche Pretargeting-Verfahren durchein verbessertes Zielverhältnisoder eine erhöhteabsolute Dosis an den Zielzellstellen im Vergleich zu herkömmlicherKrebsdiagnose oder -therapie gekennzeichnet. Eine allgemeine Beschreibungvon Pretargeting-Verfahren kann in U.S. Patent Nr. 4,863,713, 5,578,287und 5,630,996 gefunden werden. Darüber hinaus sind typische Pretargeting-Ansätze untenzusammengefaßt.
Pretargeting-Verfahren bestehen auszwei allgemeinen Typen: Drei-Schritt-Pretargeting-Verfahren und Zwei-Schritt-Pretargeting-Verfahren.
Das Drei-Schritt-Pretargeting-Protokollschließtdie Verabreichung eines Targeting-Gruppe-Ligandenkonjugates ein, dem es ermöglicht wird,sich an einer Zielstelle anzusammeln und im Kreislauf verdünnt zu werden.Dies wird von der Verabreichung eines anti-Liganden gefolgt, deran das Targeting-Gruppe-Ligandkonjugat bindet und ungebundenes Targeting-Gruppe-Ligandenkonjugataus dem Blut entfernt, sowie an Targeting-Gruppe-Ligandenkonjugat an der Zielstelle bindet.Daher erfülltder anti-Ligand eine zweifache Funktion bei der Entfernung von Target-Gruppe-Ligandkonjugat,das nicht an der Zielstelle gebunden ist, sowie die Anbindung andie Zielstelle, um einen Targeting-Gruppe-Liganden anti-Ligandenkomplexzu bilden. Zuletzt wird ein diagnostisches oder therapeutischesaktives Mittel-Ligandenkonjugat, das eine schnelle Gesamtkörper-Entfernungaufweist, verabreicht.
Wenn das aktive Mittel-Ligandenkonjugatim Kreislauf in die Nähedes an die Zielstelle gebundenen Targeting-Gruppe-Liganden : anti-Ligandenkomplexkommt, bindet der anti-Ligandteildes Komplexes an den Ligandenteil des zirkulierenden aktiven Mittel-Ligandenkonjugats,was ein Targeting-Gruppe-Ligand : anti-Ligand : Ligand-aktives Mittel \"Sandwich\" an der Zielstellebildet. Weiterhin, da das nicht-gebundene diagnostische therapeutischeaktive Mittel an einen schnell entfernenden Liganden angebrachtist (anders als eine langsam entfernte Targeting-Gruppe, wie zumBeispiel Antikörper,Antikörperfragment)stellt diese Technik eine verringerte nicht-Target-Aussetzung gegenüber demaktiven Mittel zur Verfügung.
Alternativ beseitigen die Zwei-Schritt-Pretargeting-Verfahrenden Schritt der Verabreichung des oben angegebenen anti-Liganden.Diese \"Zwei-Schritt\"-Verfahren umfassendie Verabreichung von Targeting-Gruppe-Ligand oder Targeting-Gruppe-anti-Ligand,gefolgt von der Verabreichung von aktivem Mittel, konjugiert an dasgegenüberliegendeMitglied des Ligand/anti-Ligand-Paares.
Als ein optionaler Schritt in denZwei-Schritt-Pretargeting-Verfahren der vorliegenden Erfindung wird Ligandoder anti-Ligand, der spezifisch so aufgebaut wurde, um eine Entfernungs-Funktionzur Verfügungzu stellen, verabreicht, um die Entfernung von zirkulierenden Targeting-Gruppe-Ligandoder Targeting-Gruppe-anti-Ligand zu beschleunigen. Daher wird indem Zwei-Schritt-Pretargetingansatz das Entfernungs-Mittel nichtentweder direkt oder durch das vorher verabreichte Zielzell-gebundeneTargeting-Gruppe-anti-Ligand oderTargeting-Gruppe-Ligandkonjugat an die Zielzellpopulation gebunden.
Eine Targeting-Gruppe in den Pretargeting-Verfahrender vorliegenden Erfindung wiest die funktionelle Eigenschaft auf,daß siean eine definierte Zielzellpopulation bindet, wie zum Beispiel Tumorzellen.Bevorzugte Targeting-Gruppen, die in dieser Hinsicht brauchbar sind,sind Antikörper(polyklonal oder monoklonal, wie zum Beispiel menschliche monoklonaleAntikörperoder \"humanisierte\" Maus- oder chimäre Antikörper, die auchals Targeting-Gruppenin Übereinstimmungmit der vorliegenden Erfindung brauchbar sind. Einige Beispielevon humanisierten Antikörpernschließendiejenigen ein, die CHO produziert sind, in Wirtszellen wie zum BeispielPflanzen (z. B. Mais, Sojabohne, Tabak und ähnliches), Insekten, Säugern, Hefenund Bakterien. Die humanisierten Antikörper können diejenigen sein, die andas durch den AntikörperNR-LU-13 gebundene Antigen binden. Bevorzugterweise kann der humanisierteAntikörperkeine N-verbundene Glycosylierung besitzen oder seine N-verbundeneGlycosylierung wurde post-Expression modifiziert, um die Immunogenizität oder Toxizität zu verringern.
Die vorliegenden humanisierten Antikörper können potentiellanti-Tumoraktivitätaufweisen, auch ohne die Anbringung an andere diagnostische odertherapeutische aktive Mittel, aufgrund der Anwesenheit von menschlichenkonstanten Sequenzen, die menschliche Effektorfunktionen zur Verfügung stellenkönnen.Jedoch, währendAntikörper (therapeutischeoder diagnostische Mittel)-Konjugate eine allein in der Therapieund Diagnostik bekannte Anwendung aufweisen, werden in den bevorzugtenAusführungsformender vorliegenden Erfindung humanisierte Antikörper in den Pretargeting-Verfahrenals prototypische Targeting-Gruppen verwendet werden.
Ligand/anti-Ligand-Paare, geeignetzur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen Biotin/Avidinoder Streptavidin, Haptene und Epitope/Antikörper, Fragmente oder Analogadavon, einschließlich Mimetika,Lectine/Kohlenhydrate, Zinkfingerproteine/dsDNA-Fragmente, Enzyminhibitoren/Enzyme undAnaloga und Derivate davon ein. Bevorzugte Liganden und anti-Ligandenbinden mit einer Affinitätvon mindestens ungefährKA ≥ 109M–1 oder KD ≤ 10–9 Maneinander. Biotin/Avidin oder Streptavidin ist ein bevorzugtesLigand/anti-Ligand-Paar.
Im allgemeinen werden solche Pretargeting-Verfahrenbevorzugterweise die Verabreichung eines anti-Liganden einschließen, dereine Entfernungs-Funktion zur Verfügung stellt. Diese Entfernungkann möglicherweiseder Kreuz-Vernetzung und/oder Aggregation von Konjugaten zugeordnetwerden, die im Blut zirkulieren, was zu einer Komplex/Aggregatentfernungdurch das RES (Reticuloendothel-System) des Empfängers führt. In einer Ausführungsformder Erfindung wird die anti-Ligand-Entfernung dieses Typs bevorzugterweise miteinem multivalenten Molekülerreicht. Jedoch kann ein univalentes Molekül von ausreichender Größe, daß es durchdas RES selber entfernt wird, ebenfalls verwendet werden.
Alternativ können Rezeptor-basierte Entfernungsmechanismen,z. B. Ashwell-Rezeptor oder andere Rezeptoren durch Hinzugabe vonHexoseresten, wie zum Beispiel Galactose- oder Mannoseresten ausgenutztwerden, um eine Entfernungdes anti-Liganden, anti-Ligandkonjugatesoder humanisierten Antikörpers über dieLeber zur Verfügungstellen. Solche Entfernungsmechanismen sind weniger von der Valenzdes Entfernungsmittels abhängigals die oben beschriebenen RES-Komplex/Aggregat-Entfernungsmechanismen.
Zum Beispiel, falls der Targeting-Gruppe-Ligandoder Targeting-Gruppe-anti-Ligand derivatisiert wurde, um eine Entfernungzur Verfügungzu stellen (d. h. Hinzufügungeines Hexoserests) sollte ein Entfernungsmittel nicht erforderlichsein. Bevorzugte Entfernungsmittel sind in U.S. Patenten Nrn. 5,624,896und 5,616,690 sowie der PCT-AnmeldungVeröffentlichungsnummerWO 95/15978 beschrieben.
Diagnostische und therapeutischeaktive Mittel der vorliegenden Erfindung schließen anti-Tumormittel, wie zum Beispiel Radionuklide,Zytokine, Wirkstoffe und Toxine ein.
Innerhalb der vorliegenden Erfindungbrauchbare Radionuklide schließenGamma-Emitter, Positronen-Emitter, Auger-Elektronen-Emitter, Röntgenemitterund Fluoreszenzemitter ein, wobei beta- und alpha-Emitter für die therapeutischeVerwendung bevorzugt sind. Radionuklide sind im Stand der Technikgut bekannt und schließen 123J, 125J,130J, 131J,133J,135J, 47Sc, 72As, 72Se, 90Y, 88Y, 97Ru, 100Pd,101mRd, 119Sb, 128Ba, 197Hg, 211At, 212Bi,153Sm, 169Eu,212P, 109Pd, 111In, 67Ga, 68Ga, 64Cu, 67Cu, 75Br, 76Br, 77Br, 99mTc, 11C, 13N,15O, 166Ho und 18F ein. Bevorzugte therapeutische Radionuklideschließen 188Re, 186Re, 203Po, 212P, 212Bi, 109Pd, 64Cu, 67Cu,90Y, 125J, 131J, 77Br, 211At, 97Ru, 105Rh, 198Au, 166HO und 199Ag oder 177Lu ein.
Andere anti-Tumormittel, z. B. Mittel,die gegen sich teilende Zellen aktiv sind, sind in der vorliegenden Erfindungbrauchbar. Beispielhafte anti-Tumormittel schließen Cytokine, wie zum BeispielIL-2, IL-12, Interferon α, β oder γ, Tumornekrosefaktoroder ähnliches,LectinentzündlicheAntwortpromotoren (Selektine) wie zum Beispiel L-Selektin, E-Selektin,P-Selektin und ähnlicheMoleküleein.
Zur Verwendunghier geeignete Wirkstoffeschließenherkömmlichechemo-Therapeutika, wie zum Beispiel Vinblastin, Doxorubicin, Bleomycin,Methotrexat, 5-Fluoruracil, 6-Thioguanin, Cytarabin, Zyklophosphamidund Cisplatin sowie andere herkömmlichechemo-Therapeutika wie Beschrieben in Cancer: Principles and Practiceof Oniology, 2d ed., V. T. DeVita, Jr., S. Hellman, S. A. Rosenberg,J. B. Lippicott Co., Philadelphia, PA, 1985, Chapter 14 ein. Eininnerhalb der vorliegenden Erfindung bevorzugter Wirkstoff ist einTrichothezen. Andere bevorzugte Wirkstoffe, die zur Verwendung hierals ein diagnostisches oder therapeutisches aktives Mittel bei derDurchführungder vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen experimentelle Wirkstoffe,wie in NCI Investigational Drugs, Pharmaceutical Data 1987, NIHPublication No. 88-2141, Revised November 1987 beschrieben, ein.
Verschiedene der innerhalb der vorliegendenErfindung brauchbaren potenten Toxine bestehen aus einer A- undeiner B-Kette. Die A-Kette ist der cytotoxische Teil und die B-Kette ist der Rezeptor-bindendeTeil des intakten Toxinmoleküls(Holotoxin). In dieser Hinsicht bevorzugte Toxine schließen Holotoxine,wie zum Beispiel Abrin, Ricin, Modeccin, Pseudomonas Exotoxin A,Diphtheria Toxin, Pertussistoxin und Shiga-Toxin; und A-Ketten oder \"A-Ketten-ähnliche\" Moleküle ein.
In einer bevorzugten Ausführungsformwird die Targeting-Gruppe in den Pretargeting-Verfahren einen humanisierten Antikörper oderein humanisiertes Antikörperkonjugatder vorliegenden Erfindung umfassen, das Ligand/anti-Ligand-bindendePaar wird Biotin/Avidin (z. B. Streptavidin) sein und das aktiveMittel wird ein Radionnuklid sein. Das besonders bevorzugte Pretargeting-Verfahrenist das Zwei-Schritt-Verfahren und die Verwendung eines Entfernungsmittels.Die bevorzugte humanisierte Antikörper-Targeting-Gruppe ist einAntikörper,der spezifisch an das durch NR-LU-13 gebundene Antigen bindet undder humanisierte Antikörperbesitzt keine Glycosylierung oder seine Glycosylierung wurde chemischmodifiziert.
Der Fachmann im Stand der Technikkann leicht auf Basis der Lehren dieser Anmeldung und den hier genanntenAnmeldungen eine effektive diagnostische oder therapeutische Dosisund ein Behandlungsprotokoll bestimmen. Dies wird von Faktoren wiezum Beispiel dem bestimmten ausgewählten therapeutischen oder diagnostischenMittel, der Zuführroute,dem Typ von Target-Stellen, der Affinität der Targeting-Gruppe für die Target-Stellevon Interesse, jeglicher Kreuzreaktivität der Targeting-Gruppe mitnormalem Gewebe und dem Zustand des Patienten abhängen, obdie Behandlung neben anderen Faktoren allein oder in Kombinationmit anderen Behandlungen durchgeführt wird.
Zum Beispiel wird im Fall von humanisiertemAntikörper-Avidin-oder Streptavidinkonjugaten in Pretargeting-Strategien eine geeigneteDosis von ungefähr10 bis ungefähr2500 mg, weiter bevorzugt von ungefähr 50 bis 1500 mg und am meistenbevorzugt von ungefähr100 bis 800 mg reichen. Die Dosierung des Ligand-aktiven Mittelkonjugats,zum Beispiel einem Radionuklid – Biotin-enthaltendenKonjugat wird im allgemeinen von ungefähr 0,001 bis ungefähr 10 mgund weiter bevorzugt von ungefähr0,1 bis 2 mg reichen. Zum Beispiel reicht eine geeignete Dosierungvon Ligand-aktivem Mittel, Y-90-DOTA-Biotin, von ungefähr 10 bis 300 mCi in 0,1 bis2,0 mg. Auch kann In111 bei 1–10 mCiallein oder in Kombination mit Y90 verwendetwerden. Die Radioaktivitätsbereichehängenvon dem verwendeten Isotop ab.
Im allgemeinen werden solche Pretargeting-Verfahrendie Verabreichung eines Entfernungsmittels einschließen. DieDosierung des Entfernungsmittels wird eine Menge sein, die ausreichendist, um das vorher verabreichte Konjugat aus dem Kreislauf wesentlichzu entfernen, d. h. mindestens ungefähr 50%, weiter bevorzugt mindestensungefähr90% und am meisten bevorzugt annäherndoder 100%. Im allgemeinen wird dies mehrere Tage nach der Verabreichungdes humanisierten Antikörper – Streptavidinkonjugatsverabreicht, bevorzugterweise 1 bis 5 Tage danach, weiter bevorzugtmindestens 1 bis 2 Tage danach. Im allgemeinen hängt die Bestimmung, wann mandas entfernende Mittel verabreicht, von der Targetaufnahme und demendogenen Entfernen des Targeting-Gruppen-Konjugats ab. Besondersbevorzugte Entfernungsmittel sind diejenigen, die eine Ashwell-Rezeptor-vermittelte EntfernungzurVerfügungstellen, wie zum Bespiel galactosylierte Proteine, z. B. galactosyliertesbiotinyliertes humanes Serumalbumin (HSA) und kleine Moleküle-Entfernungsmittel,die Galactose und Biotin enthalten. Im Fall von HSA-basierten Entfernungsmittelnwird eine typische Dosierung das Entfernungsmittels im Bereich vonungefähr100 bis 1000 mg und weiter bevorzugt ungefähr 200–500 mg liegen.
Falls ein Entfernungsmittel verabreichtwird, wird das Ligand-aktive Mittelkonjugat bevorzugterweise ungefähr 2 bis12 Stunden danach verabreicht.
Die Konjugate können durch bekannte Verfahrender Verabreichung verabreicht werden. Bekannte Verfahren der Verabreichungschließenbeispielhaft unter anderem intraperitoneale Injektion, intravenöse Injektion,intramuskuläreInjektion, intranasale Verabreichung ein. Die intravenöse Verabreichungist im allgemeinen bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhindurch die Präsentationder folgenden Beispiele beschrieben. Diese Beispiele werden zurVerdeutlichung und nicht zur Begrenzung angeboten.
BeispieleBEISPIEL 1HUMANISIERTE SEQUENZENVON NRX451Im wesentlichen wurde die cDNA-Sequenz,die fürdie variablen Regionen von NR-LU-13-Antikörper (das Hybridom, daß den Antikörper herstellte,wurde bei der American Type Culture Collection als ATCC ZugangsnummerSD3273, umgewandelt zu ATCC Zugangsnummer CRL-12360 hinterlegt)durch bekannte Verfahren kloniert und sequenziert. Die cDNA-Sequenzender klonierten leichten und schweren Sequenz von NR-LU-13 sind in 2 enthalten. Unter der Verwendungdieser Sequenzen wurde die Aminosäuresequenz der Fv-Region vonNR-LU-13, die die gesamte variable leichte und schwere Region enthielt,aufgeklärt.
A. HumanisierungsprotokollKurz gesagt, umfaßt das Humanisierungsprotokolleinen Zyklus von Sequenzanalyse und molekularem-Modeling, wie in 1 dargestellt wird. Sequenz-humaneAb-Daten wurden aus der Immunglobulin-Sequenzdatenbank erhalten(E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services, Fifth Edition, 1991)und strukturelle Daten wurden aus der Brookhaven-Datenbank erhalten(F. C. Bernstein et al., J. Molec. Biol. 112: 535–42, (1977)).
Die Antikörper schwere und leichte Kettensequenzenvon NR-LU-13 wurden mit einer Datenbank von menschlichen Sequenzpaaren(Immunglobulin leichte und schwere Ketten, die von demselben Klonabstammten) verglichen. Basierend auf diesem Vergleich wurde die ähnlichstemenschliche Sequenz ausgewählt,um das Gerüstfür dengrafted-Antikörperzur Verfügungzu stellen. Die Sequenzen der Maus Komplementarität-bestimmendenRegionen (CDRs) von NR-LU-13 wurden dann auf das ausgewählte menschlicheGerüst übertragen.Dieses Verfahren ergab die \"anfängliche\" humanisierte Fv-Sequenz.
Diese anfängliche humanisierte Sequenzwurde dann durch Testen von Sequenzen in dreidimensionalen Modellenverfeinert. Ein Modell der Ausgangs-Maussequenz und der Ausgangs-putativenhumanisierten Sequenz wurde konstruiert. Äquivalente Restpositionen inden Mausmodell und dem humanisierten Modell wurden verglichen. Restein dem humanisierten Modell, von denen vorhergesagt wurde, daß sie dieStruktur der CDRs störenwürden,wurden \"rückmutiert\", d. h. die Mausgerüstrestewurden wieder hergestellt. Die Modelle wurden dann unter der Verwendungder modifizierten Sequenzen konstruiert und – wurden nochmals mit dem Maus-Fv-Modellverglichen. Dieser Zyklus von Modellierung einer \"Rückmutation\" und Vergleichen derselben mit dem Mausmodellwurde fortgeführt,bis die Konformation der CDRs in dem humanisierten Modell eng mitden CDR-Konformationen in dem parenteralen Mausmodell übereinstimmten.Das spezifische schrittweise Verfahren, das zu den vorliegendenhumanisierten schweren und leichten Sequenzen abgeleitet von NR-LU-13 führte, istin 1 enthalten.
B. SequenzanalyseDie variablen Sequenzen des NR-LU-13-Antikörpers wurdenmit 58 Paaren von K-schwere Kettenpaaren verglichen, die bekannteCDR sind, die als funktionelle Antikörper zusammen exprimiert werden.Das am meisten identische Sequenzpaar wurde als dasjenige des menschlichenAntikörperklonsR3.5H5G\'CL gefunden(A. Manheimer-Lory et al., J. Exp. Med. 174: 1639–52, (1991)).Der NR-LU-13-Antikörperenthältein KV/hllc-Kettenpaar. Der R3.5H5G\'CL-Antikörper ist ein KI/hl-Kettenpaar.Daher wurden beide leichte und schwere Ketten aus den am meistenhomologen menschlichen Klassen ausgewählt.
Die NR-LU-13 leichte und schwereKettensequenzen wurden mit einer Datenbank von Immunglobulin-Sequenzenverglichen, um abnormale Sequenzpositionen zu identifizieren. Diejeweilige Sequenz fürjede Restposition zeigte, daß dieschwere Kette-Gerüstregion3 (HFR3) die am meisten abnormale Region innerhalb der NR-LU-13-Antikörpersequenzwar, und insbesondere war Position Cys 181 abnormal. In den meisten untersuchtenSequenzen (90%) wurde diese Position durch einen Tyr-Rest besetzt,der einen integralen Teil der VL/VH-Schnittstelle bildete. Die Restfrequenzeninnerhalb von ausgewähltenPositionen sind in 7a-7f dargestellt.
C. Modell-Konstruktioni. Modell-ProtokollDie Modelle wurden unter der Verwendungdes vorher durch Martina et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:9268–72(1989) und Pedersen et al., Immunomethods 1: 126–36 (1992) beschriebenen kombiniertenAlgorithmus konstruiert.
Wenn immer möglich, wurden die CDRs auskanonikalen Schleifen (Chothia et al., Nature 342: 877–83 (1989))modelliert. Die verbleibenden Schleifen wurden unter der Verwendungeiner Kombination von Datenbanksuchen und ab initio-Verfahren unter derVerwendung des konformationellen Suchprogramms CONGEN von R. E.Bruccoleri und M. Karplus, Biopolyers 26: 137–68 (1987) modelliert. Im Fallvon NRX451 wurden die CDRs L1, L2, L3, H1 und H2 aus kanonikalenSchleifen gebildet. Die CDR H3 wurde unter der Verwendung einerDatenbanksuche an der Basis der CDR und einer ab initio-Fragmenterzeugungfür denzentralen Teil der Schleife konstruiert, um zu versuchen, den konformationellenRaum zu füllen.Die CDR H3 wurde auf eine kombinierende Stelle aufgebaut, die nurdie Rückgradatomeder kanonikalen Schleifen und alle Atome aus den Gerüstrestenenthielt. Alle CDR-Seitenketten wurden unter der Verwendung vonCONGEN rekonstruiert.
Die Modelle wurden Energie-minimiert.Bei der Minimierung wurde das Rückgraddes Gerüstesfixiert, obwohl es den Rückgrad-Seitekettenund den CDRs erlaubt wurde, sich zu bewegen.
ii. Überblick über \"Rückmutationen\"Anfängliche \"Rückmutationen\" (Ersetzen von Mausgerüstresten)von CDR-grafted NRX451 (der \"anfänglichen\" nominalen Sequenz)wurden identifiziert, wo die kanonikale Klassifizierung der CDRsdurch die Veränderungin der Gerüstsequenzverändertwurde. Nur eine solche Position wurde identifiziert – Arg 193 (R3.5H5G\'CL)/Ala 193 (NRX451).Diese Position ist eine kanonikale Determinate für CDR H2 (die in Graft 2 unddanach inkorporiert wurde). Jede Restposition innerhalb 5A einesCDR-Rests, der einen veränderten Resttypin der R3.5H5G\'CL-Gerüstsequenzaufwies, wurde \"zurückmutiert\", falls die Seitenkettenoder Rückgradkonformationsignifikant zwischen dem NRX451 und R3.5H5G\'CL-Modell verändert wurde. Auf diese Weisewurden Restpositionen Ser 55, Thr 141, Tyr 181, Ala 182, Met 191,Ser 198 und Ala 218 \"rückmutiert\" (inkorporiert inGraft 4 und danach).
Zuletzt wurden alle Restunterschiedezwischen dem R3.5H5G\'CL-Gerüst und demNRX451-Gerüstvisuell inspiziert. Zwei weitere Restpositionen nahe den CDRs wurdenidentifiziert (Thr 75 und Phe 77) und \"rückmutiert\".
iii. Humanisiertes ModellIn den finalen NRX451/R3.5H5G\'CL-Modellen liegendie Reste der leichten und schweren Kette variable Regionen, diesich zwischen NR-LU-13 und NRX451-humanisierten Sequenzen unterscheiden,hauptsächlichan der Basis der Fv-Domäne in Richtungdes C-Teils des Fab-Fragments (siehe 5).Die Modelle wurden unter der Verwendung von ProCheck (v.2.1) (R.A. Laskowski et al., Instruction Manual, \"Procheck v.2.1: Programs to check thestereochemical quality of protein studies\", Oxford Molecular Ltd. (1993)) analysiert.Die 6 enthält molekulareModelle von NR-LU-13 und dem ersten humanisierten Fv abgeleitetdavon, NRX451.
4. HumanisierteSequenzDie humanisierten leichten und schwerenSequenzen sind jeweils von NR-LU-13 abgeleitet, bezeichnet als NRX451schwere und leichte Ketten und sind in 3 und 4 dargestellt.Die variablen Sequenzen von NR-LU-13 und humanisiertem NRX451 sindin 5 verglichen. Die Ketten sind getrenntnumeriert.
Daher wurden basierend auf diesenSequenzen DNAs synthetisiert, die für solche humanisierten variablenRegionen kodierten.
BEISPIEL 2ALLGEMEINE METHODOLOGIEZUR KONSTRUKTION VON HUMANISIERTEN VARIABLEN REGIONENSynthese variabler RegionenDie humanisierten variablen Regionenwurden als eine Serie von überlappendenOligonukleotiden synthetisiert. Jede vollständige variable Region war 400bis 450 Basen lang.
Ungefähr 16 Oligonukleotide (Oligos)wurden synthetisiert, um sowohl die schweren und leichten Kettenabzudecken. Die Oligos erreichten in ihrer Größe von 40 bis 88 Basen. Dieanhybridisierten Genfragmente wurden durch PCR amplifiziert undkloniert. Jede variable Region schloß Restriktionsstellen ein,um eine Klonierung zu erleichtern, eine Leadersequenz, um die Sekretionaus eukaryontischen Zellen zu steuern und eine Splice-Donor-Stelle, umeine präziseZusammenfügungmit der konstanten Region zu ermöglichen.
EukaryontischerExpressionsvektorEin Vektor wurde konstruiert derin der Lage war, stabil eukaryontische Zellen zu transfizieren und hoheExpressionsspiegel der Antikörperkettenzu vermitteln. Ein käuflicherhältlicherVektor, der den CMV-Promotor und -Enhancer und das Neomycin-Resistenzgenenthielt wurde modifiziert, um einen zweiten CMV-Promotor und -Enhancer,Immunglobulin-konstante Regionen und ein DHFR-Gen zu enthalten.
Der Vektor pCDNA3 wurde von InvitrogenCorp. (San Diego, CA) erworben. Dieser Vektor ist in 8 dargestellt. Das Neomycin-Resistenzgenvon pCDNA3 ermöglichtdie Selektion von G418 resistenten Transfektanten in eukaryontischenZellen. Dieser Vektor enthältprokaryontische Elemente, die eine Selektion und Vermehrung in E.coli ermöglichen.
Ein zweiter CMV-Promotor und eineEnhancer-Region wurden unter der Verwendung PCR, um die exisitierendenCMV-Elemente zu kopieren, gefolgt von Einfügung in pCDNA3, hinzugefügt. Genauergesagt, wurden Oligonukleotide NX62 (CCTGACGAATTCGTTGACATTGATTATTGAC)und NX63 (CCTGACGCGGCCGCTTCGATAAGCCAGTAAGC) synthetisiert, um anjeweils die 5\'und3\'-Ende von CMVzu hybridisieren. NX62 und NX63 wurden synthetisiert, um jeweilsEcoRI- und NotI-Restriktionsstellen einzuführen. Die PCR-Verfahren wurdedurch Standardverfahren durchgeführt,und das sich ergebende Fragment wurde mit EcoRI- und NotI-Restriktionsstellenverdaut. Plasmid pCDNA3 wurde ebenfalls verdaut, und das Fragmentwurde durch Standardverfahren, die im Stand der Technik gut bekanntsind, eingefügt.Das erhaltene Plasmid wurde als pCMV4 bezeichnet.
Die kappa-konstante Region und dasvorhergehende Intron wurden aus menschlicher peripherer Blutlymphozyten-DNAdurch PCR isoliert. Die Oligonukleotide NX64 (GTTCGGCTCGAGCACAGCTAGCATTATCTGGGATAAGCATGCTG)und NX65 (GTTACGGGGCCCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG) wurden synthetisiert,um jeweils an das Intron, das dem konstante Region Exon vorangingund dem 3\'-Endeder konstanten Region, zu hybridisieren. NX64 enthielt sowohl XhoI-und NheI-Restriktionsstellen. NX65 enthielt eine ApaI-Restriktionsstelle,im Anschluß andas konstante Region Stocodon. PCR wurde durch Standardverfahren durchgeführt. DieFragmente wurden durch XhoI und ApaI verdaut und in pCMV4 durchStandardverfahren eingefügt.Das erhaltene Plasmid wurde als pC4-CK3 bezeichnet.
Die menschliche gamma1-konstanteRegion, einschießlichdem vorhergehenden Intron und der anschließenden Polyadenylierungsstellewurde aus menschlichem Plasmacytom (MC/CAR, ATCC CRL 8083) DNA durchPCR isoliert. Die Oligonukleotide NX66 (GTACGCCGGATCCCAGACACTGGACGCTG)und NX67 (CATTCGGAATTCGAACCATCACAGTCTCGC) wurden synthetisiert,um jeweils an das vorhergehende Intron und die Polyadenylierungsstellezu hybridisieren. NX66 enthielt eine BamHI-Stelle. NX67 enthielteine EcoRI-Stelle im Anschluß andie Polyadenylierungsstelle. Die PCR wurde durch Standardverfahrendurchgeführt. DasFragment wurde in pCDNA3 durch Standardverfahren eingefügt. Daserhaltene Plasmid wurde pGamma1-4 genannt.
Die humanisierten variablen Regionender schweren und leichten Ketten wurden auf ähnliche Weise synthetisiert.Eine Serie von acht überlappendenOligonukleotiden wurden fürjede variable Region plus native Maus-Leader-Sequenz synthetisiert.Die internen 6 Oligonukleotiden reichten von 79 bis 88 Basen inder Längemit Überlappungenvon 19 bis 26 Basenpaaren. Die Außerhalb-Oligonukleotide waren40 bis 44 Basen in der Länge,und schlossen Restriktionsstellen ein (Vh; HindIII und BamHI, Vk;NotI und NheI). Die 3\'-Außerhalb-Oligonukleotideschlossen auch Intron-Splice-Donorstellen ein. Die PCRs enthieltenjeweils ein pmol der internen Oligonukleotide und 30 pmol jedesder Außerhalb-Primer. Das Temperaturprofilder Reaktion war wie folgt: 1 Zyklus von 5 min bei 94°C, und 1Zyklus von 5 min bei 72°C.Die erhaltenen PCR-Produkte wurden mit den geeigneten Enzymen Restriktions-verdautund in pC4-CK3 (Vk) oder pGamma1-4 (Vh) eingefügt, um Plasmide pVKE und p4gammaBjeweils entstehen zu lassen. Beide Plasmide wurde mit BgIII undEcoRI-Restriktonsendonuklease gespalten. Ein 6 Kilobasen(kb)-Fragmentaus pVKE und 3,2 kb-Fragment von p4gammaB wurden zusammengefügt, um pWE1A2zu bilden. Das Plasmid pWE1A2 enthielt die vollständigen humanisiertenschweren und leichten Ketten in im wesentlichen genomischer (Intron-enthaltender)Form. Die Antikörperexpressionvon COS- und CHO-Zellen, transfiziert mit pWE1A2, war sehr schlecht.
Das Plasmid wurde modifiziert, umdie Antikörpergenein cDNA-Form zu enthalten. Eine zusätzliche BGH-Polyadenylierungsregionwurde hinzugefügt,um sich an die schwere Kette cDNA anzuschließen. Das DHFR-Gen und Kontrolelementewurden hinzugefügt.
Die BGH-Polyadenylierungsregion wurdeaus pCDNA3 unter der Verwendung von PCR kopiert und in pWE1A2 alsein BamHI-/EcoRI-Fragment eingefügt.Dem erhaltenen Plasmid fehlte die gamma-konstante Region, es konntejedoch nun die cDNA-gamma-Kette als ein XbaI-/BamHI-Fragment aufnehmen.
RNA wurde von pWE1A2 transfiziertenCHO-(dhfr)Zellen mit einem käuflicherhältlichemRNA-Extraktionskit (Glas Max, Gibco BRL) extrahiert. Eine reverseTranskriptase-PCR (RT-PCR) wurde, wie durch den Hersteller angegeben,durchgeführt(Perin Elmer Cetus). In diesem Verfahren wurde NX109 (GCTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG),der an den 3\'-Terminusder gamma-Kette konstanten Region anhybridisierte, verwendet, umspezifisch eine reverse Transkriptase-Reaktion zu primen, in derdie gamma-Ketten-Messenger-RNAin cDNA kopiert wurde. NX109 und NX110 (CCGTCTATTACTGTTCTAGAGAGGTC),die innerhalb der schwere Kette variablen Region anhybridisiertenwurden verwendet; um die in der reversen Transkriptions-Reaktionerzeugte cDNA zu amplifizieren. Die PCR-Primer enthielten BamHI-(NX109) und XbaI(NX110) Restriktionsstellen, um eine Klovierungzu erleichtern. Das verdaute PCR-Produkt wurde in das Plasmid eingefügt, um p1A2.C1zu bilden.
Eine DHFR-Gen-Transkriptionseinheitwurde zu dem Plasmid hinzgefügt,um eine Genamplifikation in eukaryontischen Zellen zu ermöglichen.Vor der DHFR-kodierenden Sequenz befand sich ein SV40-Promotor unddanach folgte ein SV40-Polyadenylierungssignal.Die DNA, die fürDHFR und die Kontrollelemente kodierte, wurde durch PCR erzeugtund in p1A2.C1 eingefügt,um Plasmid p6.1.1 zu bilden.
Die leichte Ketten-Gene wurden incDNA durch den identischen Prozess, der für die schwere Kette verwendetwurde, überführt. OligonukleotidNX65 (GTTACGGGGCCCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG), das an das 3\'-Ende der kappakonstantenRegion anhybridisiert, wurde fürdie reverse Transkription verwendet und dann wurden NX65 und NXK1(CAGCGTGCGGCCGCACCATGGACATCAGGGCTCCTGCTCAG) zur PCR-Amplifikation desgesamten kappa-Ketten-Gens verwendet. Das PCR-Produkt wurde in p61.1eingefügt, umpNRX451 zu bilden. Dieses Plasmid ist in 9 dargestellt.
BEISPIEL 3EXPRESSION UND ISOLIERUNGVON FINALEM KLON NRX451c2-451c4-100NMHP-2μMHP-161E13-50μM-12G4-3E7CHO(dhfr-)(ATCC CRL 9096)-Zellenwurden in 6-Well Platten unter der Verwendung von LipofectaceTM (Gibco) mit linearisiertem pNRX451-Plasmidtransfiziert. Den transfizierten Zellen wurde es ermöglicht, sichin Iscoves modifizierten Dulbeccos Medium (IMDM) (Gibco), enthaltend10% dialysiertes fötalesRinderserum (dFBS) (Sigma) und einmal Hypoxanthin und Thymidin (Gibco),zu erholen. Nach 2 Tagen Erholung wurden die transfizierten Zellenanfangs in IMDM selektiert, das 10% dFBS und 800 μg/ml Geneticin® (Gibco) enthielt,dem jedoch Hypoxanthin und Thymidin fehlte.
Die überlebenden Zellen wurden einerGenamplifikation bei 1.000 Zellen/Napf in 96-Well Platten in IMDM,enthaltend 10% dFBS und 100 nm Methotrexat (Sigma) unterzogen. VierzehnTage-Überstände wurdenin gamma/kappa ELISA auf Antikörper-Produktiongetestet. Die am höchstenproduzierenden Wells wurden ausgewählt vereinigt und als C2- 451C4-100nm HP bezeichnet.
Diese Zellen wurden auf 100 Zellen/Wellin 96-Welt Platten in IMDM, enthaltend 10% dFBS und 2 μM Methotrexat,amplifiziert. Vierzehn Tage-Überstände wurdenin gamma/kappa ELISA getestet. Die am höchsten produzierenden Wellswurden ausgewähltund vereinigt und als C2-451C4-100 nm HP-2μM HP bezeichnet.
Dieser Pool wurde bei 1 Zelle/Napfin 96-Well Platten in IMDM, enthaltend 10% dFBS und 2 μM Methotrexat,kloniert. Vierzehn-Einundzwanzig Tage-Überstände wurden in gamma/kappa ELISAgetestet. Die höchstenproduzierenden Klonen wurden in IMDM, enthaltend 10% dFBS und 2 μM Methotrexat,gehalten und in IMDM, enthaltend 10% dFBS und 10, 50 oder 200 μM Methotexat,passiert.
Der am höchsten produzierende Klon wurdeausgewählt(C2-451C4-100nm HP-2μMHP-161E12-50 μM) und 2Runden von begrenzter Verdünnungsklonierungin 96-well Platten in IMDM, enthaltend 10% dFBS und 50 μM Methotexat,vor der Zellbank unterzogen. Der finale Klon wurde als C2-451C4-100nm HP-2μM HP-161E12-50μM-12G4-3E7bezeichnet.
BEISPIEL 4IMMUNREAKTIVITÄT VON NRX451Von dem humanisierten NRX451-Antikörper wurdegezeigt, daß ereine Immunreaktivitätzeigte, wie durch kompetitiven Immunreaktivitäts-ELISA unter der Verwendungdes Maus-NR-LU-10als einem Vergleich. Diese Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen,daß derhumanisierte Antikörpermehr als 65% der Immunreaktivitätvon NR-LU-10 zeigte.
Das Protokoll für den kompetitiven Immunreaktivitäts-ELISAist im folgenden angegeben.
KompetitiverImmunreaktivitäts-ELISADie Immunreaktivität wird ineinem kompetitiven Bindungs-ELISA ermittelt, wo es Standard Maus-NR-LU-10und Testantikörperermöglichtwird, mit Peroxidase-markiertem Maus NR-LU-10 um die Bindung an einen NP40(Sigma)-Extraktder KSA-Antigen-positiven LS174 Zellinie kompetitiv zu sein. Plattenherstellung: Beschichtet96-Well Platte mit 100 μl/wlloptimierter Verdünnungvon NP40-Extrakt von LS 174. Inkubiere auf Trocknung über Nachtbei 37°C.Reagenzherstellung:Verdünnungsmittel: PBS+ 5% Hühnerserum(Sigma) + 0,5% Tween 20 (Sigma) (PCT)Standard-und Testantikörper:Verdünne Standard-und Testantikörperauf 12 μg/ml inPCT. Führe9 log2-Verdünnungenin PCT durch.Peroxidase-NRLU-10:Verdünne aufoptimierte Konzentration in PCT.
Füge100 μl Peroxidase-NR-LU-10zu 500 μlvon jeder Verdünnungvon Standard- und Testantikörper für finaleKonzentrationen von 10 μg/ml(66,67 nm) auf 0,2 μg/mlhinzu. Test: WaschePlatte in PBS + 0,5% Tween 20 unter der Verwendung eines automatisiertenPlattenwaschgeräts. Füge 100 μl Verdünnung inzweifachen Ansätzenzur Platte hinzu. Inkubiere bei Raumtemperatur für 60 Minuten. Wasche wie oben.Füge 100 μl Substrat-Puffer zujedem Well hinzu. Inkubiere bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Ablesen auf automatisiertemPlattenlesegerät.Berechnungen: Unterder Verfolgung einer log-logit-Transformation der Daten, wo Kurvenan die selbe Steigung angepaßtwerden, wird die Konzentration des nicht-markierten Kompetitor-Antikörpers, diefür 50%Inhibierung (k) benötigt,bestimmt. k Standard-/k-Test × 100 =% Immunreaktivität
BEISPIEL 5Einige Variabilität in der Gewebeaufnahme vonradiomarkierten Antikörpernvon Untersuchung zu Untersuchung wird beobachtet. Das beste Verfahrenfür einenin vivo-Vergleichvon zwei verschiedenen Antikörper-Konstruktenschließteine Markierung jedes mit verschiedenen Isotopen (z. B. I-131 undI-125) und Koinjizieren eines äquimolaren Gemischesder Antikörperin Tumor-tragende Nacktmäuseein. Experimentell entfernt dies ein Ausmaß von Inter-Tier-Variabilität aus denBioverteilungsdaten. Dies wurde zum Vergleich von CHO-produziertenhumanisiertem NR-LU-13 („NRX451\") und HybridomproduziertemMaus-NR-LU-10 durchgeführt.Da dies zwei vollständigverschiedene Proteine sind, wurden einige Unterschiede in den absoluten Pharmakokinetikenerwartet und beobachtet. Jedoch, wenn auf die verschieden Blut-Pool-Konzentrationen, diein jedem Gewebe vorhanden waren, korrigiert, wurde von diesen beidenProteinen gefunden, daß siezu jedem Zeitpunkt analoge Profile an Bioverteilung zeigten. Dieskann aus 12 entnommenwerden. Der in 12 gezeigteWert sind die Verhältnisse,definiert durch Nehmen (% injizierte Dosis/Gramm Gewebe), geteiltdurch die (% injizierte Dosis/Gramm an Blut) für jedes Antikörper-Konstrukt.Gewebeproben waren Blut, Schwanz (die Stelle der Injektion), Haut,Muskel, Knochen, Lunge, Leber, Milz, Magen, Niere, Intestine und Tumor(subkutaner SW-1222 Colonkarzinom-Xenografte). Mit einer Ausnahmeblieben die durchschnittlichen Werte jeder Gewebe alle unterhalb1,0 füralle hauptsächlichenOrgane und Gewebe, was von wenig spezfischer Rückhaltung von radiomarkiertemAntikörperaußerhalbdes Blutstammenden Beitrags an Radioaktivität anzeigend war. Die Ausnahmeist Tumor, wo beide Konstrukte übereinstimmendezunehmende spezifische Lokalisierung über die Zeit von nahezu identischerGrößenordnungzeigen. Diese Daten unterstützendie in vitro-Vermittlung, so daß einevolle Immunreaktivitätdurch das humanisierte Konstrukt zurückerhalten wurde und so daß wenigStörungin der insgesamten Nicht-Zielgewebe-Verteilung durch den Humanisierungsprozess ausgeübt wurde.
Trotz der Tatsache, daß wederder CHO- noch der Larven-NRX451 in GMP-Reinheit hergestellt wurde, wurdeeine vorläufigezweifach Marker Coinjektionsstudie in dem selben Xenograft-Modelwie oben durchgeführt.Die Ergebnisse der Bioverteilungen, die zu 4, 24, 48 und 168 Stundennach der Koinjektion der Proteine durchgeführt wurde, zeigte, daß sie bemerkenswert ähnlichegesamte Lokalisierungsmuster besitzen. Auch durch Flußzytrometriegab es keine nachweisbare Bindung von irgendwelchem NR-LU-10 anrote Blutzellen, Granulozyten, Monozyten oder Lymphozyten.
Die Pharmacokinetik und Bioverteilungsanalysenjeder Form von NRX451 wurden in Nacktmäusen durchgeführt, dieeinen menschlichen Colonkarzinom-Xenograft (SW1222) trugen. 13 zeigt die Bioverteilungvon NRX451 hergestellt in CHO-Zellen, Tabakpflanzenzellen und Insektenlarven.Der Antikörperwurde in jedem Fall mit 125I radiomarkiert.Vier Mäusepro Gruppe wurden in die Schwanzvene mit 50 oder 100 μg Antikörper injiziert.Die Verteilung der Radioaktivitätin Blut, Schwanz, Lunge, Leber, Milz, Magen, Niere, Intestine undTumor wurde bei 4, 24, 48, 120 und 168 Stunden bestimmt.
Das Gesamtmuster zeigte eine übereinstimmendabnehmende Konzentration von Antikörper in Blut und in allen Weichgewebenzu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten. Die in vivo-Immunreaktivität wird durch das positive Verhältnis vonTumor zu Blutzählungenzu jeden Zeitpunkten 24–168Stunden und durch die Zunahme in Tumor-Counts über die 0–48 Stunden-Periode hinweggezeigt. Kein signifikanter Nicht-Target-Rückerhalt von Radiomarker waraußerhalbder Blutpool-Aktivitätin jedem Organ ersichtlich.
BEISPIEL 6CHEMISCHE MODIFIKATIONVON NRX451Das für die chemische Modifikationvon NRX451, hergestellt gemäß Beispiel1 bis 3, verwendete Oxidations-/Reduktionsverfahren wird beschrieben.In diesem Beispiel wurden 50 mg CHO-produziertem NRX451 auf 5,0mg/ml mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer 50 ml Erlenmeyerflascheverdünnt.Die Lösungwurde konstant währenddes Verfahrens bei 150 U/min unter der Verwendung einer Magnetrührplatte gerührt. Zuder Antikörperlösung wurden1,0 ml (10% v/v) von 0,4 M Natriumphosphat, pH 7,0 hinzugefügt, wasden pH der finalen Lösungauf 7,0 einstellte. Methionin (8,2 mg) wurde dann zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, so daß die finaleKonzentration 5,0 mM ist. Fürden Oxidationsschritt wurden 117,6 mg von Natriummetaperiodat (NaJO4) zu der gerührten Antikörperlösung hinzugefügt, um einefinale Konzentration von 50 mM zu erhalten. Der Oxidationsreaktionwurde es ermöglicht,für 20Minuten bei 25°Czu rührenund dann wurde das Reaktionsgemisch mit 310 μl Ethylenglycol gelöscht. Nachweiteren 20 Minuten wurde das Reaktionsgemisch dann mit 2,0 mg/mlmit 0,5 M kaltem Natriumborat bei pH 9,0 (25% des finalen Volumens)und 7,44 ml PBS-Verdünnung.
Fürden Reduktionsschritt wurde die Lösung auf 4°C in einem Eisbad gekühlt gefolgtvon einer Zugabe von 94,6 mg Natriumborhydrid (NaBH4),um eine finale Konzentration von 100 mM zu erhalten. Nach Rühren bei4°C für 3 Stundenwurde das Gemisch mit Natriumtetrathionat behandelt und die oxidierte/reduzierteAntikörperlösung wurdedann in PBS-Puffer ausgetauscht, einem geeignetem Lagerpuffer.
Die Lectin-Bindungsprofile des oxidierten/reduziertenCHO-produzierten NRX451 und nichtoxidiertem CHO-produziertem NRX451wurden verglichen, um das Ausmaß derKohlenhydrat-Modifikation zu bestimmen. Es gibt eine besondere Veränderungin den Lectin-Bindungsprofilen von NRX451 und oxidiertem reduziertemNRX451, wie in 14 gesehenwerden kann. Das terminal-verbundene Sialinsäure alpha (2-) an Galactoseoder N-Acetylgalactosaminund ein Galactose-B (1-40-N Acetylglucosamin, das auf dem nichtoxidiertenNRX451 vorhanden ist, wurden verändert.Beide dieser Kohlenhydrate sind gegenüber der Oxidation durch Perjodatempfindlich und scheinen verändertworden zu sein.
Die C\'MC- und ADCC-Tests wurden an zwei verschiedenenZellinien durchgeführt,MCF-7, ATCC Nr. HTB 22 und SW1222, die das mit NRX451 reaktive Antigenexprimieren. 15a und 15b zeigen, daß sehr wenigC\'MC-Aktivität mit demoxidierten/reduzierten NRX451 assoziiert ist. Jedoch weist nichtbehandeltes NRX451 hohe Spiegel von C\'MC-Aktivität auf. 15c zeigt zwei Kontrollenvon NRX451, Eine, die unter der Verwendung von N-Glycosidase F (PNGnaseF) deglycosyliert wurde, einem Enzym, von dem bekannt ist, daß es alleTypen von Asparagin-gebundenen N-Gylcane hydrolysiert. Die andereKontrolle ist NRX451, welches in der Anwesenheit von Tunicamycin,einem bekannten Glycosylierungsinhibitor, kultiviert wurde. Beideder Kontrollen zeigen eine verringerte C\'MC-Aktivität in den in vitro-Tests. 15d zeigt, daß die ADCC-Aktivität in allender Kontrollen sowie in dem oxidierten/reduzierten NRX451 intaktbleibt. Wenn NRX451 und oxidiertes/reduziertes NRX451 in ein Maus-Modelinjiziert wurden, war die Bioverteilung identisch, wie in 16a, b und c gezeigt.
NRX451 und oxidiertes/reduziertesNRX451 wurden gemäß GMP hergestelltund eine geeignete Dosismenge im Anschluß an die Pretargeting-Methodologiewurde an Patienten mit Krebs verabreicht, um die Blutentfernungzu beobachten und zu vergleichen. 17 zeigt,daß dieBlutentfernung der zwei Typen von NRX451 bis 24 Stunden nach derInjektion äquivalentwar.
BEISPIEL 7KLINISCHE AKTIVITÄT VON CHO-EXPRIMIERTEMNRX451In einem Beispiel dieser Methodologiewerden Maiszellen mit einem geeignetem Vektor transfiziert (z. B.U.S.-Patente Nrn. 5,120,657; 5,015,580; 5,149,655; 5,405,779; 5,503,998;5,506,125; 5,525,510 oder 5,584,807), der die Gene für NRX451und der deglycosylierten Mutante von NRX451 enthält. Die deglycosylierte Mutantevon NRX451 wurde durch Herstellen einer Punkt-Mutation an Position297 (dem Ende der CH2-Domäne) aufder schweren Kette eines Asn zu Gln hergestellt, wodurch die N-verbundeneGlycosylierungsstelle beseitigt wurde. Die Antikörper wurden exprimiert undgereinigt und auf ADCC und C\'MCgegen die menschliche Brust-Andenokarzinom-Zellinie MCF-7 (HTB 22ATCC Lagerstätte)getestet.
Fürdie C\'MC-Studienwurden MCF-7-Zellen (2 × 106) mit 51Cr für 2 Stundenbei 37°Cmarkiert. Nach mehrfachen Waschungen in Kulturmedium (DMEM/F12,10% fötalesKälberserum)wurden die Zellen zu 96-Well Rundboden-Mikrotiterplatten bei 104 Zellen pro Well hinzugefügt. NRX451-Antikörper, hergestelltin CHO-Zellen (Säugetier),hergestellt in Mais und die deglycosylierte Mutante, auch in Maishergestellt, wurde in log10-Verdünnungen,beginnend bei 5 μg/ml,hinzugefügt.Zusätzlichwurde menschliches Serum als eine Quelle an Komplement bei einerfinalen Konzentration von 10% hinzugefügt. Die Volumen der Wells wurden auf200 μl eingestellt.Nach einer 3,5 stündigenInkubationsperiode bei 37°Cwurden die Platten zentrifugiert und 100 μl Volumen wurden von jedem Wellgesammelt und in einem Packard-Gamma-Zähler gezählt. Zusätzlich zu der durch den Antikörper undKomplement induzierten spezifischen Freisetzung wurde die spontane Freisetzungvon 51Cr durch Sammeln von Überständen ausWells, die die Zellen alleine enthielten, bestimmt. Die Gesamtfreisetzungwurde durch Hinzufügenvon 0,1% zu NP40 zu den Wells und Sammeln von 100 μl Volumen,wie oben, bestimmt. Die spezifische Freisetzung wurde durch Subtrahierender spontanen Freisetzung aus jeder Testprobe und der gesamt möglichenFreisetzung und Teilen der eingestellten Testfreisetzung durch dieeingestellte Gesamtfreisetzung (Prozent Cytoxizität) berechnet.Alle Proben wurden in dreifachen Ansätzen gesammelt und die Datenals ein Mittel und der Standard-Abweichung dieser Werte präsentiert.
Im Fall der ADCC-Analyse wurden dieselbenVerfahren verwendet, wie fürC\'MC beschrieben,mit der Ausnahme, daß anstellevon 10% menschlichem Serum menschliche periphere Blut-Lymphozyten-Effektorzellenbei einem Effektor zu Targetzellen Verhältnis von 25 : 1 hinzugefügt wurden.Die Platte wurde vor dem 3,5 stündigenInkubationstest zentrifugiert, um eine Effektor- und Zielzellbindungzu erleichtern.
Die Ergebnisse, gezeigt in 18 und 19, zeigen, daß der NRX451-Antikörper, hergestelltin CHO-Zellen, effizient C\'MCund ADCC vermittelt. Zusätzlichvermittelt in Maiszellen produzierter NRX451 ADCC, jedoch nichtC\'MC. Zuletzt wardie in Maiszellen hergestellte Asn zu Gln Mutante vollständig ineffektivbei der Vermittlung von sowohl C\'-MC oder ADCC.
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein FachmannIgG1 humanisierte Antikörperherstellen kann, die nicht in der Lage sind, aufgrund von post-translationalenModifikationsunterschieden zwischen der Pflanzen- und Säugetierzell-ExpressionC\'-MC zu vermitteln.Zusätzlichführt eineMutation eines Asn zu Gln zu der Beseitigung von ADCC durch dieUnterbrechung einer Glycosylierungsstelle. Zusammen zeigen dieseDaten, daß maneinen Antikörperauf eine Effektorfunktion, basierend auf der Auswahl des Expressionssystemsoder einer Kombination von einzelnen Stellenmutationen für die N-verbundeneGlycosylierung und die Auswahl eines Pflanzenexpressionssystems,zuschneiden kann.
BEISPIEL 8ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESEVON NRX451Die N-Glycosylierungsstelle in derCH2-Domäneder menschlichen Immunglobulin schweren Kette wurde ortsspezifischdurch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mutagenisiert. Die OligonukleotideNX156 (5\' AGCAGTACCAA AGC ACG TAC CGG GTG 3\')und NX157 (5\' TACGTGCTTTGGTA CTG CTC CTC 3\')wurden synthetisiert (DNAgency, Malvern, PA), um an die kodierenden(NX156) und nicht-kodierenden (NX157) Stränge des menschlichen schwereKette Gens überdie Region hinweg, die die N-Glycosylierungsstelle enthält (Asn-Ser-Thr),zu hybridisieren. Beide Oligonukleotide enthielten eine zwei-Basen-Fehlpaarung, dieso aufgebaut war, um ein Codon von AAC (Asparagin) zu CAA (Glutamin)zu mutieren. In der ersten Runde an PCR wurde in getrennten ReaktionenNX156 mit einem StromabwärtsprimerNX113 (5\' GCTGACGGATCCTCATTTAC CCGGAGACAG GGAG 3\')gepaart und NX157 wurde mit einem Stromaufwärtsprimer NX110 (5\' CCGTCTATTA CTGTTCTAGAGAGGTC 3\') gepaartund Verwendung von Plasmid PNRX451 als einem Templat und Ultma-DNA-Polymerasegemäß den Angabendes Herstellers (Perkin Elmer, Branchburg, NJ). Die erhaltenen PCR-Produktewaren 476 Basenpaare fürdie NX110/NX157-Primer und 634 Basenpaare für das NX156/NX113-Primerpaarund umfaßtenTeile der schweren Kette, die sich stromaufwärts und stromabwärts jeweilsvon der Mutation erstreckten. Diese PCR-Produkte wurden aus Agarosegelen über Geneclean(Biolol, Vista, CA) gereinigt und zu einem kontinuierlichem Fragmentin einer zweiten PCR unter der Verwendung von Primern NX110 undNX113 kombiniert. Das erhaltene PCR-Produkt war 1190 Basenpaareund enthielt die gewünschteMutation. Das Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen SstII undBamHI verdaut, um ein 471 Basenpaar-Fragment zu erzeugen, was inden Expressionsvektro pNRX451 kloniert wurde, wobei es das N-Glycosylierungsstellen-enthaltendeWildtyp-Genfragment ersetzte.
BEISPIEL 9IN VIVO EVALUIERUNG VONNRX451 GESAMTEM ANTIKÖRPERHERGESTELLT IN MAISSAMENGereinigter NRX451 gesamter Antikörper ausMaissamen wurde mit 125J radiomarkiert undmit dem CHO-Zell produzierten Maus-NR-LU-10 Gesamtantikörper, radiomarkiertmit 131J, verglichen. Ein äquimolares Gemischder zwei Antikörper(25 μg/25 μg) wurdeintravenösin Nacktmäuse(20–25g) injiziert, die subkutane SW-1222 Kolonkarzino-Xenografts trugen,und die Blutentfernung wurde im Anschluß an die i. v.-Injektion des selbenGemisches in nichttumortragende Mäuse ermittelt.
Studie #1:T = 0, i. v.-Injektion eines Gemischesvon 25 μg 131J-Maus-NR-LU-10 Gesamtantikörper (muLU-10) und25 μg 125J-Mais-hergestelltem NRX451-Gesamtantikörper inNacktmäusen(20–25g), die subkutane SW-1222-Colonkarzinon-Xenografts trugen. Die Tierewurden 4, 24, 48, 120 und 168 Stunden nach der Verabreichung getötet undpräpariert.Tumor und Nich-Zielgewebewurden gewogen und zum Nachweis von 131J und 125J gezählt.Eine getrennte Gruppe von nicht-tumortragenden Balb/c-Mäusen wurdemit demselben Gemisch injiziert und serielle Blutproben wurden genommen,um die Rate des Entfernens der Radioaktivität aus dem Blut zu vergleichen.
Ergebnisse:Wie in 20 gezeigt, wurden beide Isotopen innahezu identischen Proben aus dem Blut entfernt, sowohl in der frühen (α-Phase) Verteilung,und der kurzfristigen späterenEliminierung-dominierten (β-Phase) Phase.Die Eliminierungshalbwertszeiten wurden als 77,0 Stunden für den humanisiertenNR-LU-13-Antikörper(huLu-13) gegenüber74,3 fürdie co-injizierte Mausform berechnet. Im Hinblick auf Blutverweilszeitgibt es keinen erkennbaren Unterschied zwischen NRX451-Gesamt-Antikörper undMaus-NR-LU-10.
Die Bioverteilung der co-injiziertenKonstrukte war ebenfalls sehr ähnlich.Gezeigt in 21a und 21b sind die Blut-, Weichgewebs-und Tumorkonzentrationen von Radioaktivität in tumortragenden Nacktmäusen zufortschreitenden Zeiten nach der Verabreichung. Beide Konstruktezeigen ähnlicheAbnahmekonzentrationen in allen Weichgeweben, die dem Zeitverlaufder Eliminierung aus dem Blut folgt. Es gibt wenige Hinweise vonnichtspezifischer Rückhaltungvon Radioaktivitätin irgendeinem Gewebe, mit der Ausnahme von Tumor. Das Tumoraufnahmeprofilzeigt eine Zunahme in der Konzentration von Radioaktivität nach 48Stunden, wobei die %i. d./g-Werte bei 120 Stunden aufgrund des fortfahrendenTumorwachstums verschwunden waren (die aktuelle Menge, %i. d., vonbeiden Isotopen in Tumor bei 120 Stunden ist fast doppelt von derjenigenzu irgendeinem vorhergehenden Zeitpunkt). Beide Maus- und humanisierteAntikörperzeigten quantitativ ähnliche Tumoraufnahmeprofileim Hinblick auf Rate, Ausmaß undRückerhaltder Aufnahme. In der in vivo-Evaluierung von jedem Gesamt-Antikörper gibtes keine nennenswerten Unterschiede zwischen hu-NR-LU-13-Gesamt-Antikörper (exprimiertin Maissamen) und der Mausform (Hybridomzellen).
Studie #2:Aufbau:T = 0, i. v.-Injektion von 50 μg 125J-NRX451 chemisch konjugiert an Streptavidin(NRX451/SA) in Nacktmäuse(20–25g), die subkutane SW-1222 Colonkarzinom-Xenografts trugen. Die Tierewurden bei 4, 24, 48, 120 und 168 Stunden nach der Verabreichunggetötetund präpariert.Tumor und Nicht-Zielgewebe wurden gewogen und zum Nachweis von 125J gezählt.
Ergebnisse:Die Evaluierung des gereinigten NRX451-Gesamtantikörpers ausMaissamen, fortgesetzt mit der chemischen Konjugation dieses Materialsan Streptavidin, und der anschließenden Verwendung von „pre-Targeteter\"-Tumorzuführung. Zuerstwurde jedoch eine Evaluierung des Streptavidinkonjugats alleinedurchgeführt. In 22 gezeigt sind die Blut-,Weichgewebs- und Tumorkonzentrationen von Radioaktivität in tumortragendenNacktmäusenzu fortschreitenden Zeiten nach der Verabreichung. Es gibt wenigHinweise auf nicht-spezifische Rückhaltungvon Radioaktivitätin irgendeinem Gewebe, mit der Ausnahme von Tumor. Das Tumoraufnahmeprofilzeigt eine Zunahme in der Konzentration von Radioaktivität bis zu120 Stunden. Das gesamte Muster zeigt eine übereinstimmende abnehmendeKonzentration von Antikörperim Blut und allen weichen Geweben zu fortschreitenden Zeitpunkten.Die in vivo-Immunreaktivitätwird durch das positive Verhältnisvon Tumor-zu-Blut-Konzentrationen zu allen Zeitpunkten von 24–168 Stundenund durch die Zunahme in der Tumorlokalisierung über die 0–48 stündige Periode hinweg gezeigt.Der höchsteWert der Tumoraufnahme bei 40–50%ID/gist ähnlichzu dem mit muNR-LU-10/SA beobachteten, sowie mit dem wie oben beschriebenen nicht-konjugiertenAntikörper.Der Tumorrückhalt über dieZeit hinweg ist ähnlichzu den historischen Kontrollen von muNR-LU-10/SA. Wenig signifikante Nicht-Ziel-Retentionvon Radiomarker ist oberhalb der Blut-Pool-Aktivität in jedem Organ zu dem Zeitpunkt24–168Stunden ersichtlich. Hohe Werte in allen gut durchspülten Gewebenbei 4 Stunden könnenmit der hohen Blut-Pool-Aktivitätzu diesem Zeitpunkt zusammenhängen.
Studie #2 (Fortsetzung):Aufbau:T = 0, i. v.-Injektion von 400 μg 125J-NRX451-Gesamtantikörper (Maissamen) chemisch konjugiertean Streptavidin (NRX451/SA) in Nacktmäuse (20–25 g), die subkutante SW-1222Colonkarzinom-Xenografts tragen. t = 20 Stunden, i. v.-Injektionvon 100 μgvon synthetischem Ausscheidungsmittel (GN16LCBT). t = 26 Stunden,i. v.-Injektion von 1,0 μg 111Jn-DOTA-Biotin. Die Tiere wurden bei 2,24, 48 und 120 Stunden nach der Verabreichung von 111In-DOTA-Biotin(28, 50, 74 und 144 Stunden von t = 0) getötet und präpariert. Tumor und Nicht-Zielgewebewurden gewogen und fürden Nachweis von 125J und 111Jgezählt.Getrennte Gruppen von nicht-Tumour tragenden Balb/c-Mäusen wurdenmit 400 μg 125J-NRX451/SAinjiziert, gefolgt von 24 Stunden mit Kochsalzlösung oder 100 μg synthetischemEntfernungsmittel (GN16LCBT), und serielle Blutproben wurden genommen,um die Rate des Entfernens der Radioaktivität aus dem Blut zu vergleichen.
Ergebnisse:Wie in 23 gezeigt, wurde die Radioaktivität langsamaus dem Blut auf eine Weise eliminiert, die ähnlich zu dem nicht-konjugiertenAntikörperist, sowohl in der frühen(α-Phase) Verteilungund der späteren Eliminierungs-dominierten(β-Phase)Phase. Die Injektion von synthetischem Entfernungsmittel bei 24Stunden, ergab eine schnelle Abnahme der Blutradioaktivität auf Spiegel 10% der Ausgangskonzentration.Ein leichter Anstieg in der Blutradioaktivitäts-Konzentration ( 1%) wird von 24–48 gesehen, übereinstimmendmit historischen Ergebnissen, die mit dem muLU-10/SA-Konjugat erzieltwurden. Der Nadir in der Serumkonzentration war ausreichend, umeinen verringerten Hintergrund fürdie Pretargeting-Experimente herzustellen.
Die Evaluierung von NRX451/SA indem vollen Pretargeting-Modus wurde durch Befolgen des oben aufgelistetenDosierungsschemata erreicht. In 24A gezeigtsind die Blut-, Weichgewebe- und Tumorkonzentrationen von 125J-Radioaktivität, die mit dem NRX451/SA-Konjugat assoziiertist, zu den Zeitpunkten im Anschluß an die Entfernungsmittelund DOTA-Biotin-Verabreichung. Die Blutspiegel sind relativ gering, übereinstimmendmit den Ergebnissen der Studien in den nicht-tumortragenden Mäusen unddie Radioaktivität,die gewöhnlichim Blut vorhanden ist, wurde auf die Leber lokalisiert, übereinstimmendmit der Rezeptor-vermittelten Ausscheidung, die mit der Verwendungdes GN16LCBT-Entfernungsmittelassoziiert ist. Die Tumoraufnahme, während offensichtlich geringerals die in 22, istaktuell größer in stöchiometrischenMengen von NRX451/SA, unter der Berücksichtigung daß die Datenin 22 aus der Verabreichungvon 50 μgvon NRX451/SA gegenüber400 μg vonNRX451/SA in 24A Datenabstammten. Der Tumorrückhalt über die Zeithinweg ist ähnlichzu historischen Kontrollen von muNR-LU-10/SA, verwendet in dem selben Dosierungsformat.Wenig signifikante Nicht-Ziel-Rückhaltvon Radiomarker ist oberhalb der Blut-Pool-Aktivität in jedem Organund dem durch die Leber verarbeiteten Material ersichtlich.
24B zeigtdie entsprechenden Blut-, Weichgewebe- und Tumorkonzentrationenvon 111In-Radioaktivität, die mit der DOTA-Biotin-Verabreichungassoziiert ist. Niedrige Konzentrationen in allen Geweben, außer demTumor, werden gesehen, wobei die Rate, das Ausmaß und der Rückerhalt von Tumor-assoziierter Radioaktivität zu allenZeitpunkten mit derjenigen übereinstimmt,die unter der Verwendung des muLU-10/SA als einem Targeting-Mittel beobachtetwurde. In der Voll-Pretargeting-Anwendung, unter der Verwendungvon chemischen Konjugaten an Streptavidin, gibt es keine wesentlichenUnterschiede zwischen NRX451-Gesamtantikörper (exprimiert in Maissamen)und der Maus-Form (Hybridomaexprimiert).
Aus dem vorangehendem wird es ersichtlichsein, daß,obwohl spezifische Ausführungsformender Erfindung hier zum Zwecke der Verdeutlichung beschrieben wurden,verschiedene Modifikationen gemacht werden können ohne sich von dem Geistund dem Bereich der Erfindung zu entfernen.
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